乔建新 刘熙鹏 刘 明 曹 兵

EffectofGabexateMesilateonNeuronalApoptosisinRatswithCerebralIschemiaReperfusionandItsMechanism.QiaoJianxin,LiuXipeng,LiuMing,etal.TheFirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Hebei075000,China

AbstractObjectiveTo investigate the effect of Gabexate Mesilate (GM) on neuronal apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion (I/R) rats and explore its mechanism.MethodsTotally 120 male SD rats were randomly divided into Sham group, I/R group, nimodipine (NMP) 2mg/(kg·d) group and GM 5, 10, 20mg/(kg·d) group,n=20.The rat model with cerebral ischemia-reperfusion was prepared by blocking the middle cerebral artery for 2 hours, and the drugs were given by tail vein injection after the model was completed, once a day for 7 days. The pathological change of brain tissue was examined by HE staining and the apoptosis was observed by TUNEL. The antioxidant enzyme (SOD, GSH-Px) activity and MDA content in brain tissue were determined by biochemical analysis. The expression of cleaved caspase-3, NF-κB, endoplasmic reticulum stress apoptotic pathway related protein(p-JNK, CHOP) were determined by Western blot.ResultsCompared with I/R group, the brain tissue morphological changes and cell damage in GM 10, 20mg/(kg·d) and NMP 2mg/(kg·d) groups were significantly improved, the cell apoptosis were significantly improved and the AI were decreased, the activity of SOD, CAT were increased and the content of MDA was decreased. The expression of cleaved caspase-3, NF-κB, p-JNK, CHOP were down-regulated. All of the differences were significant (P<0.05 orP<0.01). Compared with NMP 2mg/(kg·d) group, the brain tissue lesions and apoptotic conditions were better in GM 20mg/(kg·d) group. The AI was decreased, the SOD activity was increased and MDA content was decreased, the expression of NF-κB, p-JNK, CHOP were down-regulated, all of the differences were significant (P<0.05).ConclusionGM can inhibit neuronal apoptosis in brain I/R rats, which may be related to inhibiting oxidative stress, down-regulating cleaved caspase-3 and NF-κB protein expression and blocking the endoplasmic reticulum stress apoptotic pathway related.

KeywordsGabexate Mesilate; Cerebral ischemia-reperfusion; Apoptosis; Endoplasmic reticulum stress; Oxidative stress

缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，约占脑卒中患者的80%，具有较高的致残、致死率和复发率，恢复时间长且预后不理想，给家庭和社会带来沉重负担。及时恢复血流再灌注挽救缺血半暗带神经元是改善预后的关键，但病理生理学研究发现，缺血性脑卒中及实现再灌注后将导致缺血区线粒体能量代谢障碍、呼吸链受阻而诱发活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)大量产生，导致缺血半暗带神经元凋亡而加重缺血性脑损伤[1～3]。加贝酯(gabexate mesilate，GM)是一种非肽类酶抑制剂，目前临床上用于治疗急性轻型(水肿型)胰腺炎，有研究发现，GM能够通过抑制氧化应激、细胞凋亡而对肝脏缺血再灌注损伤、小肠缺血再灌注损伤起到保护作用[4,5]。但GM是否对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡具有抑制作用的文献报道尚不多见。

材料与方法

1.材料：(1)药物与试剂：注射用甲磺酸加贝酯(GM，成都天台山制药有限公司)；注射用尼莫地平(北京四环科宝制药有限公司)；SOD、GSH-Px、MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；cleaved caspase-3、NF-κB、c-Jun 氨基端激酶(p-JNK)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、β-actin单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。(2)实验动物：SPF级雄性SD大鼠120只，体质量230±10g，购自承德医学院实验动物中心 [实验动物许可证号：SCXK(冀)2017-001]；适应性饲养1周后进行实验，饲养环境：温度25±1℃、相对湿度60%±5%、12h光照黑暗交替，自由饮水进食。

2.动物分组、造模与给药：(1)分组：对120只SD大鼠进行编码后，按照数字表法随机分为6组，即假手术组(Sham组)，I/R组，NMP 2mg/(kg·d)组和GM 5、10、20mg/(kg·d)组，每组20只。(2)脑I/R模型制备[6]：手术前12h禁食不禁水，实施麻醉后沿颈部正中切口，夹闭颈总动脉并结扎颈外动脉后，由颈外动脉切口并插入直径0.235mm的线栓进入颈内动脉，遇阻力止，固定线栓后逐层缝合皮肤并擦拭碘伏进行消毒处理，2h后撤出线栓实现再灌注；Sham组除不插入线栓外，其余同模型组。(3)给药：精确称取GM和NMP粉针剂加入适量0.9%氯化钠溶液制备浓度5、10、20mg/ml的GM溶液和浓度2mg/ml 的NMP溶液；造模完成后，GM 5、10、20mg/(kg·d)组尾静脉注射浓度5、10、20mg/ml的GM溶液，NMP 2mg/(kg·d) 组同步给予浓度2mg/ml的NMP溶液，假手术组和模型组给予0.9%氯化钠溶液，注射剂量均为1ml/kg，1次/天连续7天。给药完成6h后行各指标检测。

3.脑组织病理学检查和神经细胞凋亡观察：各组随机选取10只大鼠，麻醉后开胸暴露心脏，心脏灌注300ml 0.9%氯化钠溶液、300ml 4%多聚甲醛溶液后断头取脑，去除小脑和脑干后置4%多聚甲醛溶液继续固定72h，依次行脱水、透明、石蜡浸润包埋和4μm厚度连续切片、脱蜡水化处理后，行HE染色(苏木精染色10min、0.5%盐酸乙醇分化3s、95%乙醇1min、0.5%伊红乙醇染色1min、80%乙醇分化3s后脱水)、中性树胶封片，然后通过光学显微镜观察脑组织病理学改变；遵照试剂盒操作说明行TUNEL染色，脱水后用50%甘油封片，通过光学显微镜观察并拍照；凋亡指数(AI)计算：每只大鼠取5张同位置切片，分别取5个不重叠视野计数凋亡细胞数(细胞核黄褐色为阳性着色)和细胞总数，AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%

4.脑组织生化指标检测：各组取剩余10只大鼠，颈部脱臼处死后迅速断头取脑组织，冰上取右侧大脑，加入9倍量冷裂解液行研磨匀浆，4℃离心(离心半径15cm、3500r/min、10min)取上清液，采用黄嘌呤氧化酶法、二硫对硝基甲酸法测定SOD、GSH-Px活性，硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。

5.脑组织蛋白表达检测：采用Western blot法检测，脑组织匀浆液经4℃离心(离心半径15cm、12000r/min、30min)取上清液，提取总蛋白并检测浓度后上样20μg，SDS-PAGE凝胶电泳分离(80V电压浓缩胶电泳后120V电压分离胶电泳)、转PVDF膜后5%脱脂牛奶室温封闭1h后，滴加兔抗鼠cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP、β-actin一抗恒4℃孵育过夜，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗37℃孵育1h，洗膜后滴加DAB显色；以β-actin为内参，以条带灰度值半定量目标蛋白表达量。

结 果

1.GM对脑I/R大鼠脑组织病理学改变的影响：Sham组大鼠神经细胞形态结构未见异常，I/R组呈现神经细胞数量减少、间隙增大，形态不规则、排列紊乱，胞膜边界不清，出现空泡变性，胞核固缩深染等病理学改变；GM各剂量组和NMP 2mg/(kg·d)组大鼠神经细胞缺血性病理改变不同程度减轻，与I/R组比较，GM 20mg/(kg·d)组缺血性病理改变明显减轻(图1)。

图1 GM对脑I/R大鼠脑组织病理学改变的影响(HE，×200)A.Sham组；B.I/R组；C.GM 5mg/(kg·d)组；D.GM 10mg/(kg·d)组；E.GM 20mg/(kg·d)组；F.NMP 2mg/(kg·d)组

2.GM对脑I/R大鼠神经细胞凋亡的影响：Sham组大鼠脑组织可见极少量凋亡细胞，I/R组凋亡细胞数量明显增多、AI较Sham组显著升高(65.37%±5.52% vs 2.45%±0.83%，P<0.01)。GM 5、10、20mg/(kg·d)组和NMP 2mg/(kg·d)组凋亡神经细胞数量明显减少，AI较I/R组显著降低(54.18%±5.06%、46.72%±4.98%、24.37%±4.05%、38.51%±4.24% vs 65.37%±5.52%，P<0.01)。与 NMP 2mg/(kg·d)组比较，GM 20mg/(kg·d)组AI显著降低(P<0.01，图2)。

图2 GM对脑I/R大鼠神经细胞凋亡的影响(TUNEL，×200)A.Sham组；B.I/R组；C.GM 5mg/(kg·d)组；D.GM 10mg/(kg·d)组；E.GM 20mg/(kg·d)组；F.NMP 2mg/(kg·d)组

3.GM对脑I/R大鼠脑组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响：与Sham组比较，I/R组脑组织SOD、GSH-Px活性显著降低而MDA含量显著升高(P<0.01)；与I/R组比较，GM 10、20mg/(kg·d)组和NMP 2mg/(kg·d)组SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)；与NMP 2mg/(kg·d)组比较，GM 20mg/(kg·d)组SOD活性显著升高，MDA显著降低(P<0.05)，两组间GSH-Px活性比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 GM对脑I/R大鼠脑组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响

4.GM对脑I/R大鼠脑组织cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表达的影响：与Sham组比较，I/R组脑组织cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表达显著上调(P<0.01)；与I/R组比较，GM 10、20mg/(kg·d)组和NMP 2mg/(kg·d)组cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表达下调(P<0.05或P<0.01)。与NMP 2mg/(kg·d)组比较，GM 20mg/(kg·d)组NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表达显著下调(P<0.01)，两组间cleaved caspase-3表达比较，差异无统计学意义(P>0.05，图3、图4，表2)。

图3 GM对脑I/R大鼠脑组织cleaved caspase-3、NF-κB蛋白表达的影响

图4 GM对脑I/R大鼠脑组织p-JNK、CHOP蛋白表达的影响

表2 GM对脑I/R大鼠脑组织cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表达的影响

讨 论

缺血性脑血管病是威胁人类健康的常见病和多发病，细胞凋亡是缺血性脑损伤进一步加重的病理关键[7～9]。本研究通过线栓法制备脑I/R大鼠模型，其脑组织呈现神经细胞数量减少、排列紊乱、胞膜边界不清、胞核固缩深染等病理性改变并且神经细胞凋亡数量明显增多，与刁长会等[10]研究报道一致。GM是一种非肽类酶抑制剂，具有抗氧化和抑制细胞凋亡的药理学作用，本研究发现，经GM干预治疗7天能够明显改善脑I/R大鼠脑组织缺血性病变并抑制神经细胞凋亡，并且GM 20mg/(kg·d)组治疗效果优于临床一线用药NMP组效果，提示GM具有抑制脑I/R大鼠脑神经细胞凋亡并改善脑组织病变的作用。

细胞凋亡是一种受多种基因蛋白和信号通路调控的细胞程序化死亡过程， cleaved caspase-3能够酶解切割细胞结构蛋白、修复蛋白等而破坏细胞内环境稳定，从而参与细胞凋亡启动和执行过程[11，12]。脑缺血再灌注后由于能量代谢障碍、线粒体呼吸链破坏将导致ROS大量产生，以ROS为底物的抗氧化酶SOD、GSH-Px合成受阻并过度消耗而导致ROS过剩，ROS直接攻击细胞膜及核酸、蛋白质等高分子发生脂质过氧化而破坏其结构，生成具有生物毒性的MDA；并且ROS能够激活NF-κB蛋白，活化后的NF-κB能够刺激促凋亡调控因子合成和释放而促进细胞凋亡[13～15]。

内质网是一种膜性细胞器，参与调节钙稳态、脂质合成和展开过程称为内质网应激，适度的内质网应激对细胞起保护作用、过度则促进细胞凋亡[16]。李爽[17]、翟美丽等[18]研究发现，内质网应激通路在缺血性脑损伤所致细胞凋亡过程中具有重要的调控作用。内质网应激通路活化与CHOP、JNK蛋白表达上调有关,而ROS则能够促进CHOP、p-JNK蛋白表达而激活内质网应激通路[19，20]。

本研究发现，经GM干预治疗7天能够降低脑I/R大鼠脑组织MDA含量并提高SOD、GSH-Px活性，下调cleaved caspase-3、NF-κB、p-JNK、CHOP蛋白表达，并且GM 20mg/(kg·d)组对MDA含量、SOD活性以及NF-κB、p-JNK、CHOP表达的调控作用优于NMP组，提示GM通过抑制氧化应激、下调cleaved caspase-3和NF-κB蛋白表达、阻断内质网应激凋亡通路，抑制脑I/R大鼠神经细胞凋亡，减轻脑组织损伤。