肖 珊 杨 烨 刘玥彤 马 瑞 朱 筠

RegulatoryEffectofLiraglutideonVisceralFatinDiabeticObeseRats.XiaoShan，YangYe，LiuYuetong,etal.DepartmentofEndocrinology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Xinjiang830054，China

AbstractObjectiveTo explore the effect of liraglutide on the expression of fat mass and obesity-associated(FTO)、AMP-activated protein kinas(AMPK) and protein kinase B(AKT) in visceral adipose tissue of diabetic obese rats and its possible mechanism.MethodsTwenty male SD rats of SPF grade were randomly divided into two groups (10 rats in each group). They were treated with liraglutide [0.6mg/(kg·d)]or saline respectively. After 12 weeks, the rats were weighed and the samples were collected. The weight of visceral adipose tissue and the levels of blood glucose, TG, TC, HDL-C and LDL-C were measured. The expression of FTO, AMPK and Akt in visceral adipose tissue was detected by RT-PCR and Western blot.T-test was used to analyze and compare the data of each group.ResultsThe results showed that compared with the control group, the body weight, visceral fat weight, blood glucose, TG, TC, LDL-C levels of rats in the liraglutide group were significantly lower (P<0.05), while the HDL-c levels were significantly higher (P<0.05). Compared with the control group, the levels of FTO, Akt mRNA and protein decreased significantly in the liraglutide group (P<0.05), and the levels of AMPK mRNA and protein increased significantly (P<0.05).ConclusionLiraglutide may be involved in the improvement of abdominal obesity in type 2 diabetes by activating AMPK pathway and inhibiting Akt pathway in visceral fat and down regulating the expression of FTO.

KeywordsLiraglutide; Diabete mellitus; FTO;AMPK;AKT

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是目前常见的慢性疾病，随着生活方式的改变及人口老龄化的加速，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和肥胖的发生率呈快速上升的趋势，并且已经成为全球性的公共卫生问题。其中，超重和腹型肥胖是T2DM的主要危险因素，可加重T2DM患者的胰岛素抵抗，影响血糖控制的效果[1]。脂肪量及肥胖相关(fat mass and obesity-associated，FTO)基因是由Frayling等[2]和Susleyici-Duman等[3]研究发现，在脂肪组织内可丰富表达的肥胖相关性基因。据报道，FTO基因的翻译蛋白可能会作为转录辅助因子调控脂肪细胞的生长和发育，调节脂肪细胞的成脂功能，影响肥胖的发生过程[4]。

多项研究表明，FTO的多态性基因与肥胖及T2DM密切相关[5]。有研究发现，腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinas，AMPK)是调控脂质代谢的关键因子，在骨骼肌细胞中可通过抑制FTO的表达减少脂质的积累[6]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路则是2型糖尿病发生、发展的经典通路，PI3K/AKT途径相关信号蛋白的活化在调节体内脂质的代谢及胰岛素抵抗中发挥重要作用。

利拉鲁肽是胰高血糖素样肽-1受体激动剂(glucagon like peptide-1 receptor agonists，GLP-1 RAs)，可通过胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)受体的介导发挥类似GLP-1的调节作用，以葡萄糖浓度依赖的方式促进胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的释放，维持血糖的稳定状态[7]。此外，GLP-1RAs还可通过延缓胃排空、增加饱腹感、抑制食欲来减少能量的摄取，对能量的平衡和体质量的控制产生直接的影响作用[8]。研究显示，长期联合应用利拉鲁肽治疗T2DM可显著降低超重及腹型肥胖T2DM患者的体质量，改善高脂血症，减少心血管疾病的发生风险[9]。

研究发现，在db/db小鼠中，利拉鲁肽可以通过激活AMPK、抑制AKT来降低体质量，减少内脏脂肪的产生[10]。因此，本研究利用高脂高糖饲料及链脲佐菌素 (streptozotocin，STZ)诱导的2型糖尿病肥胖大鼠模型，观察代谢状态及内脏脂肪组织中FTO、AMPK、AKT的表达水平的变化，探索利拉鲁肽对糖尿病肥胖大鼠内脏脂肪组织中FTO、AMPK及AKT表达的影响及其调节糖尿病肥胖大鼠内脏脂肪的可能机制。

材料与方法

1.主要材料：清洁级(SPF级)雄性SpragueDawley(SD)大鼠由新疆医科大学动物中心实验室提供，所需的高脂高糖饲料由北京博泰宏达生物技术有限公司提供。STZ购自美国Sigma公司，利拉鲁肽注射液购自丹麦诺和诺德公司，FTO、AMPK及AKT引物购自华大基因有限公司，RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒及实时荧光定量RT-PCR试剂盒均购自德国Qiagen公司，FTO、AMPK及AKT抗体购自美国Abcam公司。

2.糖尿病模型的制备及分组：20只SPF级雄性SD大鼠，体质量约180～220g，普通饲料适应性喂养1周后，给予高脂高糖饲料喂养8周，待体质量增长至400～450g时腹腔注射STZ 30mg/kg，继续予高脂高糖饲料喂养，3天后尾静脉取血，测随机血糖≥16.7mmol/L，提示糖尿病模型建造成功。将20只糖尿病模型大鼠随机分成利拉鲁肽组和对照组，每组各10只，分别给予利拉鲁肽[0.6mg/(kg·d)]或0.9%氯化钠溶液每天2次皮下注射，并持续给予高脂高糖饲料喂养及血糖监测。本研究经新疆医科大学实验动物使用和管理(IACUC)批准，严格按照动物实验申请书进行实验操作，严格遵守实验动物科学研究部的各项规章制度和条例以及《动物保护法》及相关法规的规定。

3.标本的收集与处理：在利拉鲁肽或0.9%氯化钠溶液干预12周后，禁食过夜，称体质量，以3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血。采血结束后，分离内脏脂肪组织标本，称重后将脂肪组织放入EP管，迅速放入液氮中，随后移至-80℃超低温冰箱中冻存备用。

4.血清生化指标的检测：将新鲜的血液离心后，取上层血清置于冰上待测。根据相关试剂盒说明进行操作，利用酶标分析仪测定吸光度值，并计算血清葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的含量。

5.实时荧光定量RT-PCR：取各组大鼠内脏脂肪组织，根据试剂盒提取总RNA，反转录为相应的cDNA，进行实时荧光定量RT-PCR，引物序列见表1。FTO、AMPK及AKT mRNA的表达水平测定的PCR反应总体系20μl，PCR扩增条件：95℃变性10min，60℃退火1min，95℃延伸15s，40个循环，每个样本设3复孔，以β-actin作为参照。

表1 引物序列

6.Western blot法检测：取适量液氮冻存的内脏脂肪组织，加入含磷酸酶抑制剂和蛋白酶的裂解液，超声破碎后4℃超速离心15min，收集上清液，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，取变性蛋白20微克/孔，10%的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳后按湿转法将产物转印到聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，使用含5%牛血清蛋白室温条件下封闭2h，加入一抗(FTO 1∶1000；AMPK 1∶2000；AKT 1∶1000；β-actin 1∶2000)在4℃条件下孵育过夜，TBST洗膜3次后加入HRP标记的二抗(1∶10000)在室温条件下孵育2h，洗膜3次，高敏化学发光法(ECL)处理，利用凝胶定量分析系统检测蛋白含量，以所得条带的吸光度与β-actin内参照吸光度的比值代表其表达量。

结 果

1.两组体质量及内脏脂肪的比较：与对照组比较，利拉鲁肽组大鼠体质量、内脏脂肪的重量明显降低(P<0.05，表2)。

表2 两组体质量及内脏脂肪重量

2.两组血糖及血脂水平的比较：与对照组比较，利拉鲁肽组大鼠血糖、血清TG、TC、LDL-C水平明显降低，HDL-C水平明显升高(P<0.05，表3)。

3.两组内脏脂肪中FTO、AMPK及AKT的表达水平比较：与对照组比较，利拉鲁肽组大鼠内脏脂肪FTO、AKT mRNA及蛋白的水平明显降低(P<0.05)，AMPK mRNA及蛋白的水平明显升高(P<0.05，表4、表5，图1)。

表3 两组血糖及血脂水平

表4 两组内脏脂肪中FTO、AMPK及AKT mRNA 表达

表5 两组内脏脂肪中FTO、AMPK及AKT 蛋白表达

图1 两组FTO、AMPK及AKT 蛋白的表达

讨 论

多项研究显示，FTO rs8050136位点的A等位基因既与胰岛素抵抗及炎性因子显著相关，又与BMI、腰围及臀围等肥胖标志物的升高存在密切联系[11,12]。同样，FTO rs9939609位点的多态性也与高血脂、肥胖及靶组织受体介导的胰岛素代谢改变显著相关。研究发现， SIRT-AMPK信号通路的激活可降低脂肪酸合酶及其转录因子的表达，增加脂肪酸的氧化速率，调节脂质的分解及能量代谢的过程[13～15]。在高脂诱导的C57BL/6小鼠发生肥胖的过程中，活化的AMPK可明显降低小鼠肝脏脂肪堆积，同时还可通过抑制糖异生途径达到抗糖尿病的作用。研究显示，胰岛素敏感的PI3K/AKT信号转导，可影响体内葡萄糖的平衡及脂质的稳态[16]。PI3K/AKT信号通路还参与聚焦低能量冲击波进行脂肪干细胞培养的过程[17]。肝脏脂质聚积时，抑制PI3K/AKT信号通路，可促进肝细胞自噬，减轻db/db小鼠的肝脂肪变[18]。研究表明，FTO基因在癌细胞中的表达水平明显升高，可能通过PI3K/AKT途径调控细胞代谢，参与细胞的生长，而AMPK的活化则可抑制FTO基因的表达[19]。

本研究探索拉鲁肽对糖尿病肥胖大鼠内脏脂肪FTO、AMPK及AKT表达水平的影响及其可能机制。有研究证实，利拉鲁肽在改善血糖的同时可降低载脂蛋白Ⅲ的表达，调节高血糖患者甘油三酯的水平，减少动脉粥样硬化残余脂蛋白颗粒[20]。肥胖患者中，利拉鲁肽可通过恢复其内皮功能，降低心血管事件的发生风险[21，22]。研究发现，利拉鲁肽是通过激活PKA-AMPK信号通路来改善高脂诱导的肥胖小鼠的代谢状态及血管功能障碍，提高抗氧化的能力，发挥保护心血管系统的作用[23]。研究显示，抑制AKT的活性可减少脂质的合成。在MDA-MB-231细胞中AMPK则可通过激活PP2A来刺激AKT/PKB的去磷酸化，影响AKT的活性。糖尿病肥胖小鼠在经利拉鲁肽治疗后，其肾周、附睾及大网膜脂肪构成的内脏脂肪组织AMPK的激活及AKT的抑制可导致内脏脂肪重量的降低，减轻糖尿病肥胖小鼠的体质量[10]。

本研究结果显示，糖尿病肥胖大鼠经利拉鲁肽治疗后，与对照组比较，体质量及内脏脂肪的重量明显降低(P<0.05)，血糖、TG、TC、LDL-C水平也明显降低(P<0.05)，而HDL-C水平则明显升高(P<0.05)；利拉鲁肽组大鼠内脏脂肪FTO、AKT mRNA及蛋白的水平明显降低(P<0.05)，AMPK mRNA及蛋白的水平明显升高(P<0.05)，这提示利拉鲁肽可能通过激活糖尿病肥胖大鼠内脏脂肪AMPK途径及抑制AKT途径，下调FTO的表达水平，改善2型糖尿病的腹型肥胖。但利拉鲁肽通过FTO、AMPK及AKT途径改善2型糖尿病内脏脂肪蓄积的具体调节机制尚未明确，仍是需要研究的方向。

综上所述，利拉鲁肽改善糖尿病腹型肥胖的过程可能通过激活内脏脂肪中的AMPK途径及抑制AKT途径，下调FTO的表达水平来实现，为2型糖尿病及腹型肥胖的防治提供新的理论依据。