崔圆圆 张跃祥 王玉华（内蒙古医科大学药学院呼和浩特010110）

合日乎-18散是由川木香、益智仁、生草果仁、拳参、高良姜、大黄、赤瓟子、苏木、肋柱花、诃子、金银花、绿豆、槟榔、土木香、甘草、肉豆蔻、琥珀、黄连等十八味药组成，临床功效为解毒、调经止血，用于腰腹酸痛、腹脏“黏”热、“协日”热、“赫依”热等。目前，合日乎-18散没有质量标准。川木香为方中主要药味之一，具有行气止痛的功效[1]。川木香隶属菊科川木香属，气芳香，研究表明挥发油、木质素类和倍半萜类成分为其主要的活性成分[2，3]。木香烃内酯属于倍半萜内酯类化合物，为川木香药材指标性成分之一。本文采用HPLC法测定了合日乎-18散中木香烃内酯的含量，为合日乎-18散质量标准的研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器：Waters e2695型高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司，上海）；Mettler-Toledo MS105DU型百万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，江苏）；Mettler-Toledo XPR10型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，江苏）；SBL-22DT型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司，宁波）；Heal Force NW15UV型超纯水系统（河南省予华仪器有限公司，河南）；FW400A型多功能粉碎机（材茂科技有限公司，北京）。

1.2 试药：木香烃内酯对照品（中国药品生物制品检定所，批号111524-201911）；合日乎-18散供试品四批（呼伦贝尔市蒙医医院，批号 20180701、2018071901、2018081702、2018091103）；自制样品一批（批号20190925）；甲醇为色谱纯；水为超纯水，所用其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：本实验采用Pheomenex C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇为流动相 A，水为流动相 B，梯度洗脱（0～27 min，65% A；27～31 min，65% A→80% A；31～37 min，80% A；37～39 min，80% A→65% A；39～45 min，65% A）；检测波长为 225 nm；柱温35℃；流速为1.0 mL·min-1；进样体积为10 μL。理论板数按木香烃内酯峰计算应不低于4000。

2.2 对照品溶液的制备：取木香烃内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含木香烃内酯0.1 mg的对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备：取供试品粉末约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备：按处方比例并以相同工艺制备缺川木香的阴性对照供试品，依照“2.3”项下所述供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验：在“2.1”色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录各自的色谱图。色谱图显示，在供试品溶液色谱图中，木香烃内酯与相邻峰得到基线分离；阴性对照色谱图中在与木香烃内酯对照品色谱峰对应的保留时间处无色谱峰出现，表明其他组分对木香烃内酯的测定无干扰。该方法专属性好。

2.5.2 线性关系考察：取木香烃内酯对照品约3.0 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.119 mg的溶液，分别精密吸取上述对照品溶液 1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL和25 μL注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积对进样量进行回归分析。结果显示，木香烃内酯在0.119 μg～2.7975 μg范围内呈良好线性关系（r=0.9999），回归方程为y=3267854.1394x-229386.9495。

2.5.3 精密度试验：取一份供试品（批号 20180701），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下，连续进样6帧，分别记录色谱图，木香烃内酯峰面积积分值之间的RSD值为0.85%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验：取一份供试品（批号20180701），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下，分别于 0 h、3 h、4 h、9 h、12 h进样并记录色谱图。结果显示，在12 h内木香烃内酯峰面积积分值基本稳定，RSD值为0.45%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5.5 重复性试验：取同一批号（批号20180701）供试品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下，记录色谱图。按外标法以峰面积计算木香烃内酯的含量。结果表明，供试品平均含量为0.38 mg·g-1，RSD为1.70%。该法的重复性好。

2.5.6 加样回收试验：取已知含量（批号20180701，含量为0.38mg·g-1）的供试品9份，各约1.0 g，精密称定，分别置9个具塞锥形瓶中，分成三组，每组三份，每组分别精密加入浓度为0.16 mg·mL-1的木香烃内酯对照品溶液各1 mL、2 mL、3 mL（约相当于供试品含有量的 50%、100%、150%）及甲醇 25 ml，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下，进样并记录色谱图。按外标法以峰面积计算回收率。见表1。

表1的结果显示，50%、100%、150%的加样回收率的均值为96.21%，RSD为1.72%，表明该方法的准确度好。

3 供试品测定

取四批供试品（批号 20180701、2018071901、2018081702、2018091103）各两份以及自制供试品（批号20190925）两份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下进行测定。含量测定结果见表2。

表1 木香烃内酯加样回收试验结果Table 1 Costunolide Sample Recovery Test Results

表2 供试品中木香烃内酯测定结果Table 2 Determination Results of Costunolide in the Test Samples

表2的结果显示，四批合日乎-18散供试品及自制品中木香烃内酯含量接近，批号为2018071901的样品含量稍高，含量在0.32 mg·g-1以上。

4 讨论

4.1 流动相的选择：参照《中国药典》2015年版一部“川木香”含量测定项下的测定方法[1]，以甲醇-水（65∶35）为流动相进行实验。结果显示，木香烃内酯分离度和对称性良好，但发现在合适的采集时间（30 min）里，不能出峰完全，第二帧里木香烃内酯会被第一帧里未出完的色谱峰影响，在连续进样时，会出现色谱峰拖尾及保留时间漂移的现象。故尝试流动相比例为甲醇-水（70∶30），将所有色谱峰出峰时间前移，以保证拥有合理的采集时间，但此时木香烃内酯色谱峰与其他色谱峰分离效果不佳。故将流动相比例调整为甲醇-水梯度洗脱，在保证木香烃内酯色谱峰与其他色谱峰分离度良好的前提下，使后面的色谱峰尽快冲出，缩短采集时间[5-7]。

4.2 柱温选择：比较了不同温度25℃、30℃、35℃、40℃对实验结果的影响。结果显示，随着色谱柱温度的升高，整体出峰时间前移，并不会影响木香烃内酯的分离度，故在保护色谱柱的前提下，选择柱温为35℃[4-7]。

4.3 检测波长的选择：参照《中国药典》2015年版一部“川木香”含量测定项下木香烃内酯的测定方法，选用225 nm处作为检测波长。

4.4 超声提取时间的选择：为保证被测成分提取完全，在供试品细度、提取溶剂、超声功率（250 W，频率40 kHz）一致的情况下，考察了提取时间为20 min、30 min、40 min的提取效率。结果显示，超声提取20 min、30 min和40 min时，供试品中木香烃内酯的含量基本一致。故将提取时间确定为30 min，与《中国药典》2015年版一部“川木香”含量测定项下的提取时间一致。