吴洁莹 孙逊沙 李发涛 陈劲松 谢闺娥 李 焱 吴韶清

1 广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心(广州 510623) 2 中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心(广州 510623) 3 中山大学附属第一医院(广州 510080) 4 广州医科大学金域检验学院(广州 510182)

近年来，CRISPR/Cas9(the clustered regularly interspaced short palindromicrepeats /CRISPR-associated protein 9)基因编辑技术应用于生物医学领域是研究热点之一，具有重要的研究意义和实际应用价值[1-2]。相对于归巢核酸内切酶、锌指核酸酶和转录激活样效应因子核酸酶技术，CRISPR/Cas9能够精准、快速、有效地实现目标基因的编辑，而且实验操作简单及成本低廉[3]。本研究拟构建靶向CXCR7基因的CRISPR/Cas9质粒，转染人胚肾细胞系HEK293T，编辑CXCR7基因，为进一步研究CXCR7基因在干细胞中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒及相关试剂

HEK293T细胞由中山大学中山医学院杨中汉教授馈赠；CRISPR/Cas9 骨架质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) 由北京微旋基因技术有限公司馈赠；大肠埃希菌感受态细胞DH5α购自天根生化(北京)科技有限公司；DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司；Lipofectemine 3000购自Invitrogen公司；菌液PCR试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司；Bbs I酶、PNK酶和连接酶购自NewEngland Biolabs公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 设计靶向编辑CXCR7基因的sgRNA

利用http://cripr.mit.edu 网站设计单链导向RNA(single guide RNA，sgRNA)，选择具有高度特异性且脱靶可能性低的sgRNA，本研究选择其中两对sgRNA进行实验研究(见表1)，这两对sgRNA 的靶向位点均位于CXCR7基因的第2号外显子上。

1.2.2 构建sgRNA-CXCR7-PX458 质粒

将合成的sgRNA按照文献方法进行末端磷酸化和退火[1]，并以1:200 的比例稀释。BbsⅠ酶切PX458，纯化后连接sgRNA。取连接体系2 μL转化大肠埃希菌感受态细胞DH5α，接种于含50 mg/mL氨苄西林的平板上，12～16 h后，每个平板选择3 个单菌落，分别含50 mg/mL氨苄西林的液体培养基中培养16～18 h。按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒抽提，用PCR扩增抽提质粒，上游引物用U6-F，下游引物用各sgRNA的bottom序列(见表1)，然后用上游引物进行Sanger测序鉴定。正确的质粒分别标记为sgRNA1-CXCR7-PX458质粒和sgRNA2-CXCR7-PX458质粒。

表1 sgRNA和引物序列

续表

1.2.3 质粒转染HEK 293T细胞系

按照2×105个/孔的密度接种HEK 293T 细胞到24 孔细胞培养板中，24 h后，按照Lipofectamine 3000试剂盒说明书操作指南，每孔转染sgRNA1-CXCR7-PX458质粒或sgRNA2-CXCR7-PX458质粒500 ng，72 h后采用流式细胞仪(BD FACS Aria Sorp)分选出表达GFP阳性的HEK 293T细胞，扩增培养后，小部分细胞用于提取基因组DNA，大部分细胞液氮中冷冻保存备用。提取DNA经PCR扩增后进行Sanger 测序。

2 结果

2.1 成功构建2个sgRNA-CXCR7-PX458质粒

sgRNA-CXCR7和PX458 载体质粒骨架连接后，sgRNA-CXCR7-PX458质粒转化大肠埃希菌感受态细胞DH5α，经铺板和菌落培养，提取的质粒DNA经PCR扩增(见图1)和Sanger 测序鉴定，2个sgRNA 分别插入PX458 质粒相应位置，测序结果见图2，显示sgRNA 插入了正确的位置。

图1 sgRNA-CXCR7-PX458扩增电泳图

图2 sgRNA-CXCR7-PX458质粒测序结果

2.2 两个sgRNA-CXCR7-PX458质粒分别成功转染至HEK 293T细胞

将sgRNA1-CXCR7-PX458质粒和sgRNA2-CXCR7-PX458质粒分别转染HEK 293T细胞，72 小时后，采用流式细胞仪分选GFP阳性细胞，以未转染的HEK 293T细胞为阴性对照，设定GFP的阴性边界，结果显示，sgRNA1-CXCR7-PX458质粒转染的HEK 293T 细胞中有23.42%表达GFP，sgRNA2-CXCR7-PX458质粒转染的HEK 293T细胞中有22.30%表达GFP。见图3。

图3 转染HEK 293T细胞系72h采用流式细胞术分选GFP阳性细胞

2.3 HEK 293T 细胞中的CXCR7基因被有效编辑

经Sanger 测序鉴定，sgRNA1-CXCR7-PX458质粒转染过的HEK293T细胞在第112与113位编码氨基酸之间产生了插入和/或缺失(NP_064707.1)，sgRNA2-CXCR7-PX458质粒转染过的HEK 293T细胞在第87与88位编码氨基酸之间产生了插入和(或)缺失，均为PAM之前3个碱基左右的位置，即Cas9切割双链DNA的位置，产生了重叠峰的图像，表明此处发生插入和/或缺失，因而，CXCR7基因被有效编辑。见图4。

图4 HEK293T细胞CXCR7基因被编辑后的测序图

3 讨论

CRISPR 系统由CRISPR基因簇和Cas蛋白组成，在细菌和古细菌中参与获得性免疫防御，降解噬菌体等外源的遗传物质。具体的机制为：当噬菌体首次进入宿主细胞后，CRISPR系统识别其核酸及外源DNA的PAM序列(protospacer sdjacent motif)，选取一段DNA序列加工重组到CRISPR簇的5′端，形成新的非重复间隔序列，从而将外来的基因片段整合进细菌细胞的基因组。当具有相同核酸序列的噬菌体再次入侵时，CRISPR系统转录出前体crRNA，加工成熟后与相关的Cas蛋白结合形成crRNA-Cas9蛋白复合体，然后通过碱基互补配对结合外源DNA并切割，使得形成DNA双链缺口(double stranded breaks，DSB)，从而激活细胞的修复机制。细胞通过两种机制进行修复，一种是非同源末端连接修复机制，此时可能产生几个碱基的插入或者缺失，导致相应基因发生移码突变或者无义突变，从而实现基因的敲除；另一种是通过同源重组机制修复，可以将外源性基因准确插入基因组[4-5]。CRISPR/Cas 9基因编辑技术自2013年首次应用以来，迅速被广泛应用于生物医学领域，并获得不少进展和成果[1,6]。

采用CRISPR/Cas9系统编辑干细胞内的相关基因，进行干/祖细胞分化、疾病模型建立、药物筛选和再生医学等方面的研究[7-8]。Negoro R等[9]建立了多重耐药基因(Multiple drug resistance 1，MDR1)敲除的人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stemcells，iPSCs)，能够用于药物代谢动力学研究。Wang H等[10]用CRISPR/Cas9系统敲除人胚胎干细胞的肌段同源盒2基因(muscle segment homeobox2，MSX2)，诱导该细胞分化成造血干细胞，证明该基因是胚胎干细胞分化成造血干细胞的调控基因。Golchin A等[11]认为间充质干细胞作为一种安全有效的细胞治疗资源，同CRISPR/Cas9系统的联合应用，将会极大地提高其临床利用价值和效果。Kim YK等[12]用正常人来源的诱导多能干细胞，建立了α-半乳糖苷酶缺失的细胞系，为法布瑞氏症的基础研究提供可靠的手段，为该罕见病的治疗开发新方案提供了奠定了基础。

趋化因子受体7(C-X-C chemokine receptor 7, CXCR7)是G蛋白偶联的七次跨膜蛋白受体(seven-transmembrane receptors，7-TMRs)，其基因定位于人类染色体2q37，作为CXCL12的第二受体，亲和性比CXCR4高10倍。CXCR7基因最初是从狗的甲状腺cDNA序列中分离出来的。目前已知，正常情况下，CXCR7在人的心脏、脑、脾、肾、肺、睾丸、卵巢、甲状腺和胎盘等组织中是高表达的，肝以及胸腺中表达量较低。在造血系统，CXCR7主要表达于外周血的单核细胞、粒细胞和血小板以及骨髓中的淋巴细胞和粒细胞上[13-14]。而在疾病相关研究中发现，在炎症、感染、缺血和肿瘤形成中，CXCR7的表达是上调的。另外，人类微血管内皮细胞在缺氧和酸性环境下，其CXCR7表达也是上调的。CXCR7广泛参与多种生物学功能，包括炎性应答、免疫应答、免疫监控和组织修复再生。CXCR7具有促进血管新生能力，包括胚胎发育中的血管发生，以及肿瘤生长和转移过程中的新生血管形成。已有报道表明，CXCR7在调控细胞迁移、黏附、增殖、存活和分化等方面具有重要作用[15-16]。

近年来，干细胞技术发展迅速，干细胞的基础研究和干细胞的临床应用已经成为了目前生物医学领域最活跃的研究热点之一。由于CXCR7在细胞研究领域的重要作用，使得CXCR7在胚胎干细胞、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞中的功能研究不断被报道。如Kowalski K等[17]报道，CXCR7对调节胚胎发育过程中的关键发育调节子表达是必需的，而且CXCR7参与了胚胎干细胞多能性的控制和向中胚层谱系的分化。Shao Y等[18]发现，过表达CXCR7的间充质干细胞明显促使间充质干细胞归巢至受损的肺组织，同时促进间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞的分化，并增强了间充质干细胞调节炎症反应的能力。Chen Q等[19]报道，CXCR7在神经祖细胞迁移中起重要作用，在CXCR4缺失的情况下，CXCR7激活细胞外信号调节激酶(ERK)1/2，并充当CXCL12介导的神经祖细胞迁移的功能受体。

综上所述，建立靶向CXCR7的CRISPR/Cas9基因编辑系统，对研究CXCR7的功能具有重要意义，本研究建立了该编辑系统，并在人胚肾细胞系HEK293T 中成功进行了CXCR7基因的编辑，为进一步的干细胞中的CXCR7基因编辑和功能研究奠定基础。