张晓平 罗统富 安忠诚 董黎强# 刘启明 魏 浩 黄余亮 金圣煊

1 浙江中医药大学附属第二医院 浙江 杭州 310005

2 桐乡市第二人民医院 浙江 桐乡 314500

3 杭州市富阳中医骨伤医院 浙江 杭州 311400

4 杭州创新中药标准化研究所有限公司 浙江 杭州 310051

失神经支配创面属于难愈性创面的一种类型，具有易复发、迁延不愈等特点。龙血生肌膏是我院中药验方外用膏剂，多年临床使用证实其对失神经支配创面促愈合作用疗效确切。然而中药膏剂存在颗粒粗大、涂抹欠均匀等不足，影响药物最佳疗效发挥，为进一步提高龙血生肌膏原方药物的疗效，通过借助现代制药技艺，研发其温敏凝胶新剂型，观察龙血生肌温敏凝胶对失神经支配创面中神经生长因子（NGF）表达的影响及创面促愈合的作用，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料：以2015年1月至2018年12月浙江中医药大学附属第二医院收治的40例截瘫后肢体压迫性溃疡[1]患者为研究对象，采用随机数字表法将患者分为治疗组和对照组各20例。所有病例符合纳入标准：因截瘫后导致肢体出现压迫性溃疡；年龄30～65岁；溃疡面积大小2～30cm2者；知情同意并签署知情同意书且自愿受试。并排除：合并糖尿病且血糖控制不佳者；合并严重内科原发性疾病、恶病质者；长期使用类固醇激素及免疫抑制剂者；合并严重感染，病情危重者；癌性溃疡或结核性溃疡、麻风性溃疡、梅毒性溃疡者。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 治疗方法：维持患者电解质平衡，营养支持，护理及心理干预，研究开始当天行创面彻底清创，之后按如下方法定时换药。治疗组：首先使用酒精棉球擦洗创面周缘皮肤3遍，再用0.9%生理盐水棉球擦拭创面，擦干创面周缘皮肤，计算所需龙血生肌温敏凝胶（由杭州创新中药标准化研究所有限公司制备），约0.5ml/cm2用量，用2.5ml注射器抽取，均匀涂抹于创面，再用薄膜完全覆盖创面并与引流管连接，远端封管，密闭创面。隔2天更换1次，从引流管抽吸渗液并记录。对照组：创缘及创面消毒方法同治疗组，改用龙血生肌膏（本院药剂科制备）涂抹创面，用量计算方法同上，之后用无菌薄膜及引流管覆盖、密闭创面，换药间隔同治疗组。

1.3 观察指标：分述如下。

1.3.1 创面大体观察及渗出液评分：观察患者创面的红肿、肉芽生长情况，观察渗液的性质、色泽、气味、渗出液量，根据下肢溃疡评分表(LUMT)渗液部分改良后进行评分，算出量化数值后进行统计学分析。

1.3.2 创面愈合率测算：在开始治疗当天及治疗后1周、2周、3周四个时间点的创面予以等距离拍照，将图片扫描后通过Image Pro Plus（IPP）软件处理[2]算出创面面积，测算创面愈合率。

1.3.3 HE染色成纤维细胞数观察：在治疗当天及治疗后3周对创面组织进行取材。常规消毒后，切取大小约0.5cm×0.2cm×0.2cm创面组织标本，局部压迫止血并再次消毒。取出组织，包埋切片后用二甲苯脱蜡，再经各级乙醇至蒸馏水洗，苏木素染色5min，自来水冲洗5min，盐酸乙醇分化30s，自来水浸泡15min，置伊红液2min，自来水冲洗，常规脱水，透明，封片，最后予中性树脂封固。

1.3.4 NGF免疫组化检测：取材后用石蜡包埋，切片脱蜡后，放入浓度为0.1mol/L的枸橼酸液修复液（PH=6.0）中修复，按照试剂盒操作步骤如下：用PBS漂洗5min，3次，3%H2O2消除创面组织标本内源性过氧化物酶活性，冲洗放置后擦去封闭液，分别滴加NGF一抗(均1∶50)和生物素化二抗后孵育，DAB显色剂进行切片显色，最后苏木素复染，中性树胶封片。10×40倍显微镜下观察3个视野，参考免疫组织化学半定量分级将NGF阳性结果分级为：NGF≤20%（-）；20%＜NGF≤40%（+）；40%＜NGF≤60%（2+）；NGF＞60%（3+）。

1.4 统计学方法：采用SPSS 21.0软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，3个时间点数据采用单因素重复测量方差分析，组间采用LSD法进行两两比较；等级资料用秩和检验；P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 创面大体观察：所有病例用药后创周皮肤均未见过敏、坏死现象。治疗组肉芽从边缘向中央生长，呈颗粒状，大小中等，色鲜红，轻触易出血。对照组肉芽颗粒较治疗组稍小，色淡红，易出血。

2.2 渗出情况：治疗组用药后第2d开始有大量渗出，持续约2周后逐步减少，渗液呈浅棕黄色，性质由清稀到稠厚，无异味。对照组第3d开始有中量渗出，2周后渗出量减少，呈较稠厚的乳白色液体，无明显异味。3个时间点两组渗液LUMT评分情况见表2。

表2 创面渗出液评分比较（±s，分）

表2 创面渗出液评分比较（±s，分）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别治疗组对照组3周5.05±0.76*2.80±0.69例数20 20 1周8.40±1.05*5.35±0.93 2周6.90±0.79*3.90±0.72

2.3 创面愈合率：见表3。

表3 创面愈合率比较（±s，%）

表3 创面愈合率比较（±s，%）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别治疗组对照组57.77±2.26*53.39±2.05例数20 20 1周 2周 3周28.37±1.56 27.90±2.27 39.69±2.42*36.97±2.23

2.4 成纤维细胞HE染色细胞数观察：在200倍电镜下随机选择10个视野，对视野中成纤维细胞进行计数并取平均数，结果见表4。

表4 两组成纤维细胞数量变化比较（±s，个/10HP）

表4 两组成纤维细胞数量变化比较（±s，个/10HP）

注：与用药前比较，#P＜0.05；与对照组比较，*P＜0.05。

组别治疗组对照组175.62±14.02#*162.16±22.79#例数20 20用药前 用药3周55.24±6.58 53.94±5.41

2.5 NGF免疫组化检测：见表5。

表5 NGF阳性表达信号量

3 讨论

失神经支配创面属于中医学“疮疡”的范畴，因其缠绵难愈又称为“顽疮”。病机主要为气血两虚、湿毒内蕴、脉络痹阻等。“顽疮”病位在体表，外用药物直接作用病变部位，故首选外用药。“龙血生肌膏”由金枪铁扇散化裁而来，方中主要成分地龙具有通经活络、生肌止痛和抗血栓作用。血竭为“活血圣药”，能活血化瘀止痛、敛疮生肌；乳香活血，没药散血，皆能止痛消肿生肌，外用为粉以敷疮疡，能解毒消肿，生肌止痛，二药并用，为流通经络之要药；黄柏主治口舌生疮，疮疡肿毒。故龙血生肌膏具有较好的清热、祛腐、通络、生肌之效。

截瘫后肢体压迫性溃疡因创面神经支配缺失，其愈合速度较正常创面显著减缓。结合前期研究结果及相关文献报道，我们知道NGF在创面愈合中扮演非常重要的角色，而在创面愈合过程中，成纤维细胞是形成肉芽组织及血管重建的基础[3]，故将NGF的表达及成纤维细胞的计数作为创面愈合的重要指标。本临床研究结果表明，在用药3周过程中两种剂型外用生肌中药均能够促进NGF的表达和成纤维细胞的增殖，进而加速失神经支配创面的愈合，但龙血生肌温敏凝胶疗效更优。本研究为临床使用龙血生肌温敏凝胶治疗失神经支配创面提供了理论依据，同时体现出温敏凝胶剂型较传统中药膏剂更具优势。但失神经支配创面愈合过程是一个多因素参加的复杂过程，参与的分子及相关机制复杂，中医药治疗失神经支配创面的疗效和机理仍值得进一步深入研究。