黄子圣 黄迪,3 黄宇,3 何志翔, 李佩霖 翁杰锋,3 李桃生,3 古维立,,3

1 广州医科大学附属广州市第一人民医院 肝胆外科(广州 510180) 2 华南理工大学附属第二医院 肝胆外科(广州 510180) 3 广州消化疾病中心 (广州 510180)

肝纤维化(hepatic fibrosis， HF)目前是世界上常见的疾病之一，是导致其他肝病如肝硬化和肝癌的主要原因。肝纤维化是一个动态的过程，其特征是任何病因的慢性肝损伤，包括病毒感染、酒精性肝病等引起细胞微环境变化[1-2]。长期以来，生物力学一直是肝病学研究和治疗的重点。既往研究表明，门静脉高压症，胆管梗阻等机械动力学变化，可能激活肝星状细胞向肌成纤维细胞表型转化，促进肝纤维化，其中门静脉高压被认为是决定患者功能状态的关键因素[3]。细胞间质液压力(interstitial fluid pressure，IFP)作为生物力的关键部分，对细胞的分化，生长和存活有着重要影响[4]。然而，细胞间质液压力对肝星状细胞激活和增殖的影响和以及是否影响肝细胞的表型变化目前仍然模糊不清[5-6]。我们拟通过模仿细胞间质液压力的升高，对肝星状细胞给予不同程度的机械性压力性刺激，观察压力刺激对肝脏组织细胞特性的影响效果。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

人肝星状细胞(HSC)购自Sciencell(#5300)；Triton X-100购自SIGMA(美国)，α-SMA抗体，ROCK抗体，RhoA抗体购自CST公司(美国)，药物ROCK抑制剂Y-27632购自ATCC公司(美国)；共聚焦显微镜OLYMOUS，日本。Roche LightCycler 480# PCR 仪(美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组

人肝星状细胞随机分为3组，每组3皿，其中模型组：将其置于压力箱中施加恒定的高于大气压50 mmHg压力；实验组：加入ROCK抑制剂Y-27632(浓度10 μmol)置于与实验组相同条件；对照组：不加压置于相同培养箱中。模型组及实验组分别加压1 h和12 h后取细胞于光镜观察。

1.2.2 肝纤维化相关 PCR 检测

实时荧光定量PCR法检测各组HSC细胞中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA的表达量：收集处理过12 h各组HSC细胞，加入Trizol裂解液，参照 Trizol 试剂 说明书提取各组细胞的总RNA。 以超微量蛋白核 酸定量检测仪测定 RNA纯度和浓度， 选取合格RNA样品逆转录合成cDNA。以稀释的 cDNA 为模板，使用实时荧光定量PCR检测试剂盒进行检测。α-SMA 的正向引物序列为5′GTGACGAAGCACAGAGCAAA 3′；反向引物序列为5′CTTTTCCATGTCGTCCCAGT 3′；RhoA的正向引物序列为5′CAGAAAAGGGACCCCAGAA 3′，反向引物序列为 5′GCAGCTGCTCTCGTAGCCATTTC 3′；ROCK1的正向引物序列为5′AACATGCTGCTGGATAAATCTGG 3′，反向引物序列为5′AGGAAGGCATGGTACGATGTGATACA 3′。GAPDH的正向引物序列为 5′GACTCATGACCACAGTCCATGC 3′；反向引物序列为 5′AGAGGCAGGGATGATGTTCTG 3′。反应条件为94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以 GAPDH为内参照，采用 2-ΔΔCT法计算各组HSC 细胞中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA基因的相对表达水平。

1.2.3 免疫荧光染色检测α-SMA、ROCK1、ROCK2蛋白表达

免疫荧光检测α-SMA、ROCK1、ROCK2的表达：各组细胞按实验条件处理12 h，然后应用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%Triton-X100通透10 min，封闭液室温下封闭1 h，一抗4 ℃过夜，荧光二抗室温避光孵育2 h；DAPI染色10 min，滴加封片剂封片，荧光显微镜下拍照。实验重复3次，见表1。

表1 间质液压变化对各组肝星状细胞α-SMA、ROCK1、ROCK2 荧光值比较

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 间质液压变化对人肝星状细胞的形态影响

随着间质液压的增加，经过1 h或12 h 50 mmHg 压力加压后，HSC细胞的大小和形态在光镜下并未出现明显改变。说明50 mmHg压力对细胞形态学变化影响不大，见图1。

图1 光镜下间质液压变化对肝星状细胞的形态影响

2.2 间质液压变化对人肝星状细胞中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA的表达量影响

通过 qRT-PCR 检测各组肝星状细胞α-SMA、RhoA、ROCK mRNA表达水平，可见在各组肝脏中均有表达(见图2)。通过比较对照组与模型组细胞各种细胞因子的表达，在1 h压力组中，α-SMA、RhoA mRNA的表达量均比对照组表达量增加，而 ROCK mRNA的表达量无明显变化；12 h组中α-SMA、RhoA、ROCK mRNA的相对表达量分别为6.14±0.69、0.95±0.22、1.13±0.22，12 h组中α-SMA mRNA的表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 间质液压变化对各组肝星状细胞α-SMA、RhoA、ROCK mRNA表达量比较ns P>0.05， **P<0.01(α-SMA 1h P=0.001 5，12h P=0.000 5；RhoA 1h P=0.000 1，12h P=0.065 6；ROCK 1h P=0.084 6,12h P=0.106 8)

2.3 免疫荧光染色检测间质液压变化对肝星状细胞中α-SMA、ROCK1、ROCK2蛋白表达

在人肝星状细胞中，α-SMA主要在细胞骨架上表达(见图3)，ROCK1蛋白主要在人肝星状细胞细胞质表达在细胞核内，ROCK2蛋白在人肝星状细胞细胞质和细胞核中，免疫荧光表现为绿色。免疫荧光染色结果显示：经压力处理后的肝星状细胞α-SMA、ROCK1蛋白水平增加，而ROCK2蛋白表达水平无明显改变，提示间质液压变化处理可引起肝星状细胞表达更多的α-SMA及 ROCK1蛋白。经ROCK抑制剂Y-27632处理后，各组的蛋白表达均有下降，且能降低肝星状细胞的α-SMA的表达。(见图3)

肝星状细胞的α-SMA蛋白在间质液压变化处理后表达明显，而在用ROCK抑制剂Y27632处理后，其表达明显减少。ROCK1蛋白在人肝星状细胞主要在细胞质表达，在细胞核内少许表达，在间质液压变化处理后显著表达，使用ROCK抑制剂Y27632处理后，与模型组相比其表达明显减少，而与对照组差异不大。ROCK2蛋白在人肝星状细胞细胞质和细胞核均有所表达(见图3)，在对照组中ROCK2蛋白表达量较高， 其在经压力处理后的星状细胞表达与对照组相比无明显差异，而在用ROCK抑制剂Y27632处理后，与模型组相比其表达明显减少(P<0.01)，而与对照组差异不大。

图3 间质液压变化对各组肝星状细胞α-SMA、ROCK1、ROCK2蛋白表达ns P>0.05， **P<0.01(α-SMA pre P=0.000 1，Y27 P=0.078 9；ROCK1 pre P=0.000 1，Y27 P=0.000 6；ROCK2 pre P=0.370 9，Y27 P=0.000 1)

3 讨 论

细胞是受牛顿力学定律控制的动态物理结构，具有精确感知和施加机械力的能力。它们将机械信号与化学信号整合在一起，并根据各种外部机械信号改变行为[1]。肝纤维化是一个动态的过程，其特征是任何病因的慢性肝损伤，包括病毒感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎等引起细胞微环境改变而导致的。由于体内所有细胞液体微环境会受到一些常见的机械力的影响，不同类型的细胞的机械敏感性也会有所不同，对特定机械刺激的阈值不同。既往研究表明[2]，门静脉高压症，胆管梗阻等机械动力学变化，可能激活肝星状细胞向肌成纤维细胞表型转化，促进肝纤维化，但细胞间质液压对肝星状细胞激活和增殖的影响和以及是否影响肝细胞的表型变化目前仍然模糊不清。细胞骨架从细胞外基质接收到的机械力信号不仅改变细胞本身的功能形态，而且还通过钙黏着蛋白-细胞粘附复合物转移到了相邻的细胞。细胞通过改变其微环境的组成，组织的弹性，并响应于这种抗张性互相调节。因此，通过模仿细胞间质液压的升高，我们试图对肝星状细胞给予不同程度的机械性压力性刺激，观察压力刺激对肝脏组织细胞特性的影响。

转化蛋白RhoA是Rho GTP酶家族中的一种小GTP酶蛋白。其功能主要与细胞骨架调节有关[5]。ROCK最初被认为是RhoA的下游效应子。可驱动细胞收缩，并且是纤维化病理的介质。肌成纤维细胞的ROCK活性可通过纤维化期间增加肺基质的刚度，诱导HSC向肌成肌纤维表型的分化，增加α-SMA的表达，增强肌动蛋白细胞骨架的聚合活化[7]。在纤维化过程中，ROCK介导的作用是机械敏感性的[8]。这与我们研究结果相符，当肝星状细胞暴露在高间质液压环境下，α-SMA的表达升高，且与ROCK1的表达相联系。

在组织纤维化前期，组织内部往往有强烈的炎症反应，微环境中的温度，氧气利用率，细胞因子和渗透压等会出现大幅度波动从而引起间质液压力的变化。这与我们研究发现间质液压力早期对肝星状细胞的影响相符，RhoA mRNA在肝星状细胞中只有在加压早期的表达上升，在压力后期表达与对照组无差异。我们研究发现，升高的细胞间质液压通过ROCK1而非ROCK2引发肝星状细胞的活化。在一般环境下，肝星状细胞中的ROCK1和ROCK2蛋白的表达已有着明显差异，ROCK1的表达量少而ROCK2的表达量高。在间质液压升高情况下，肝星状细胞中的α-SMA大量表达，提示肝星状细胞激活，证实了机械压力对肝纤维化的促进作用。与此同时我们发现，肝星状细胞中ROCK1的表达有着明显提高，而ROCK2表达量则几乎不变，这提示机械压力对肝星状细胞的刺激主要影响ROCK1，这为我们使用ROCK制剂治疗肝纤维化提供了依据。使用ROCK抑制剂Y27632后ROCK1和ROCK2的表达明显较少，同时α-SMA的表达也明显减少，证明了ROCK抑制剂对肝纤维化的发展的抑制效果。我们的研究表明细胞间质液压升高能通过RhoA/ROCK1信号通路引起肝星状细胞的活化，研究RhoA/ROCK1信号通路可能为将来开发一种新的临床治疗肝纤维化的方法提供实验基础。