罗俊霞， 赵建波， 张 刚， 尚航影， 张 威， 马 蕾， 郭华婷， 刘 佳， 张全智

(1.郑州市农产品质量检测流通中心， 河南 郑州 450006； 2.郑州市农业技术推广中心， 河南 郑州 450006； 3.河南恒晟检测技术有限公司,河南 新郑 451100； 4.三门峡市农产品质量安全检测中心, 河南 三门峡 472000； 5.新郑市农业技术服务中心， 河南 新郑 451100)

随着社会的发展和人们生活水平的提高，食品安全问题越来越受人们的重视，特别是在中国加入WTO后，食品安全问题受到全球的关注。于是，农业部从2001年4月启动无公害食品行动计划，率先在北京、天津、上海和深圳4个城市进行试点，并在此基础上，于2002年7月开始在全国范围内全面推进“无公害食品行动计划”。各级农产品质量安全检测机构纷纷成立，有关农产品安全检测的研究陆续开展。酶抑制-比色法快速检测农药残留的方法是现有的农药残留检测方法之一[1]，是利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对昆虫体内乙酰胆碱酯酶的活性这一毒理学反应，在酶反应试验中加入底物和显色剂，通过紫外-分光光度计在410 nm的波长下进行比色，根据吸光度值的变化计算胆碱酯酶的抑制率，从而判断农药残留是否存在[2]。目前，有很多学者纷纷对来源于动物或者植物的酶进行筛选和研究[3-7]，对商品化酶抑制-比色法快速检测试剂盒的评价和其对农药的敏感性测定的研究较少。据不完全调查，应用于商品化酶抑制-比色法快速检测试剂盒生产的酶多来源于动物酯酶，由于不同来源的酶对同一农药的敏感性不同，导致不同的商品化酶抑制-比色法试剂盒对同一种农药的检出限不一样[8-12]，所以在实际工作中检测相同的样品使用不同的试剂盒进行测定结果有较大差异。同时，因为现有农药种类繁多，商品试剂盒中未对该敏感农药及其检出限进行说明，为了解不同品牌酶抑制-比色法试剂盒对在生产中使用较多的甲胺磷、毒死蜱、甲基对硫磷、三唑磷4种有机磷农药的敏感性，对6种商品化酶抑制-比色法快速检测试剂盒的敏感性进行测定，以期为商品化酶抑制-比色法快速检测农药残留的试剂盒的选择和使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验盒 酶抑制-比色法快速检测农药残留试剂盒：深圳市A试剂盒、广州B试剂盒、广东C试剂盒、厦门D试剂盒、湖北E试剂盒、深圳F试剂盒，以下简称试剂盒A、B、C、E、D、F。

1.1.2 仪器 CL-BⅢ型16通道的农残速测仪，上海复博农业科技有限公司；SHA-C型双重恒温水浴振荡器，杰瑞尔电器有限公司；HH.W21-Cr 420型电热恒温水浴锅，北京三二八科学仪器有限公司；WH-861型漩涡混合器，上海精密仪器仪表有限公司；Rongtai 5 mL和Thermo 200 μL的移液枪；

1.1.3 试剂 1 000 mg/L的甲胺磷、毒死蜱、甲基对硫磷、三唑磷等有机磷类农药标准品，由农业环境保护科研检测所生产。使用时按需稀释成80 μg/mL的储备液。

1.2 方法

1.2.1 试剂的配制 各品牌的农药残留检测试剂盒里有缓冲试剂、酶试剂、显色剂和底物，在每次使用前，缓冲试剂用500 mL的蒸馏水溶解，酶试剂、显色剂和底物分别按各试剂盒说明书的要求进行配制；具体见表1。

表1 6种酶抑制-比色法试剂盒中各种试剂的配制方法Table 1 Preparation methods of six kinds of reagents in enzyme inhibition colorimetric assay kit

1.2.2 试验设计 在农药的测定中，农药浓度是影响测定结果的关键因素、测定时取用的提取液体积也对测定结果稍有影响。因此，试验在测定时需考虑检测农药的浓度及提取液体积。测定时取用1.1.3中的农药贮备液按2 g的称样量制备成浓度为0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg的甲胺磷、毒死蜱 、甲基对硫磷和三唑磷，各浓度设置3次重复；根据缓冲溶液或样品提取液的取用体积，针对各农药的不同浓度设置2个处理，即取用提取液3 mL和2.5 mL，分别采用6种酶抑制-比色法试剂盒(以下简称6种试剂盒)进行测定。

1.2.3 对照液的测试 分别移取缓冲溶液3 mL和2.5 mL于10 mL试管中，依次往提取液中加入0.1 mL的酶液、0.1 mL的显色剂，用旋涡混合振荡器混匀，再用电热恒温水浴锅在37℃下水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物摇匀，立即放入CL-BⅢ型16通道的农残速测仪仪器比色池中进行测定，记录ΔA值。

1.2.4 样品处理 参照国标[13]进行。往制备好的模拟样品中加入10 mL缓冲液后移取3 mL或者2.5 mL的试管中，按照1.2.3的流程操作，并记录ΔA值(测试每一组样品时加一个对照)。

1.3 6种试剂盒对4种农药测定结果的差异

1.3.1 6种试剂盒的精密度及重现性测定 根据每个处理的3次测定值计算出变异系数，考查每种试剂盒在检测过程中的精密度和测试样品的重现性。

1.3.2 6种试剂盒对4种农药的敏感性测定 根据不同浓度农药的抑制率平均值绘制抑制率对浓度的折线图，考查比较6种试剂盒中的酶对各种农药的敏感性。

1.3.3 6种试剂盒对4种农药的半抑制浓度IC50及线性范围测定 参照刘洋等[3-7,9,11-12,14-18]的方法对各品牌试剂盒测定各农药的3次测定结果，选取抑制率在100%以下的浓度值，计算抑制率对农药浓度常用对数的线性回归方程为抑制率方程、线性系数及每一种农药对各种试剂盒的半抑制浓度(IC50)。IC50的计算根据抑制率方程的Y=50%也就是抑制率为50%时，计算出相对应的X轴的值，由此计算出相对应的浓度；线性范围是抑制率为0到测定的最大的抑制率对应的浓度值之间。

1.3.4 6种试剂盒对4种农药的灵敏度测定 试验设定抑制率为10%时为试剂盒测定各农药的检测限，根据抑制率方程计算当抑制率为10%各种农药相对应的浓度，记为IC10。

1.3.5 不同提取液的测定结果比较 通过1.3.1～1.3.3的结果比较3 mL和2.5 mL样品提取体积对测定结果的影响。

2 结果与分析

2.1 6种试剂盒测定样品的重现性

由表2可知，6种试剂盒测定农药的重现性在所使用的玻璃器皿清洗较好的情况下都比较好，不同提取液用量对6种试剂盒的相对偏差无影响。相对来说，除抑制率为0的情况，对于同种试剂盒测定同一种农药，抑制率越高其相对标准偏差越小。如C、D、E试剂盒测定4种农药的抑制率的相对标准偏差基本上随着农药浓度和抑制率的增高相对标准偏差降低。

表2 6种试剂盒测定不同浓度4种农药的相对标准偏差Table 2 Determination of relative standard deviations of four pesticides with different concentrations by six kits %

2.2 6种试剂盒对4种农药的敏感性

从图1可知，6种试剂盒对甲胺磷、毒死蜱、甲基对硫磷和三唑磷4种农药的敏感性。

2.2.1 甲胺磷 E试剂盒测定甲胺磷出现异常，提取液体积为3 mL和2.5 mL均表现为在甲胺磷浓度为1 mg/kg时抑制率最大，分别为14%和9.4%，甲胺磷浓度为2 mg/kg时抑制率降为0，甲胺磷浓度为3mg/kg时抑制率略有升高。当甲胺磷浓度为0.05 mg/kg时，B、C、D、F试剂盒测定甲胺磷的抑制率差别不大，但随着甲胺磷浓度的升高，抑制率也随着升高，在0.05～3mg/kg，抑制率的增高幅度为D>C>B>F 。

2.2.2 毒死蜱 A试剂盒在测定毒死蜱时出现异常而且抑制率相对较低，基本呈平行于横轴的直线；当毒死蜱浓度为0.05 mg/kg时，D和C试剂盒测定毒死蜱的抑制率差别不大，E、F、B试剂盒测定毒死蜱的抑制率差别也不大，但是D、C和E、F、B间存在较大差异：C试剂盒测定毒死蜱的浓度为0.05 mg/kg时，3 mL和2.5 mL样品提取液的抑制率分别为50.8%和39.2%，之后急剧上升，当浓度为0.5 mg/kg抑制率均达100%；D试剂盒测定毒死蜱的浓度为0.05 mg/kg时，3 mL和2.5 mL样品提取液的抑制率分别为65.4%和58%，之后缓慢上升；当毒死蜱浓度为3 mg/kg，其抑制率分别达82.5%和78.7%。当样品提取液为3 mL，毒死蜱浓度为0.05～3 mg/kg时，B、E、F试剂盒的抑制率增高幅度分别为36.6%、28.4%和35.3%；当样品提取液取用2.5 mL时，B和F试剂盒在毒死蜱浓度为0.05 mg/kg、0.5 mg/kg、1 mg/kg的抑制率均为0，在毒死蜱浓度为2～3 mg/kg，抑制率稍有增高；毒死蜱浓度为0.05～3 mg/kg，E试剂盒的抑制率在8.4%～38.6%。

2.2.3 甲基对硫磷 B、C、F试剂盒对甲基对硫磷不敏感，甲基对硫磷浓度在3 mg/kg以下的抑制率均为0，A试剂盒测定甲基对硫磷的抑制率无规律性，D、E试剂盒测定甲基对硫磷在其浓度为0.5 mg/kg时抑制率为0或接近0，随着甲基对硫磷浓度的升高抑制率呈不同幅度的增长，但增长的幅度较小。

2.2.4 三唑磷 B试剂盒测定对三唑磷不敏感，三唑磷浓度在3 mg/kg以下的抑制率均为0；同毒死蜱一样，A试剂盒在测定三唑磷时出现异常，随着农药浓度的变化抑制率变化没有规律，基本呈平行于横轴的直线；C、D、E、F试剂盒测定三唑磷时随着三唑磷浓度的升高，其抑制率呈不同幅度的增长，当样品提取液为3 mL，三唑磷浓度为0.05～3 mg/kg时，其抑制率的增高幅度分别为73.3%、56.5%、81%和19.9%；当样品提取液为2.5 mL时，其抑制率的增高幅度分别为65.7%、43.8%、72.9%、19%。总体而言C、D、E、F试剂盒在提取液为3mL的抑制率略高于提取液为2.5mL的抑制率。

2.3 6种试剂盒测定4种农药的抑制率和农药浓度的相关性及敏感性

从表3可知6种试剂盒测定甲胺磷、毒死蜱、甲基对硫磷和三唑磷4种农药的抑制率与农药浓度的相关性及敏感性。

表3 6种试剂盒测定4种农药的抑制率和农药浓度的相关性、检出限及敏感性Table 3 Correlation, detection limit and sensitivity between inhibition rate and pesticide concentration of four pesticides determined by six kits mg/kg

2.3.1 甲胺磷 6种试剂盒中，除E和F外，A、B、C、D试剂盒测定甲胺磷的抑制率和农药浓度之间呈较好的线性关系，3 mL的样品提取液时，A、B、C、D试剂盒的抑制率和甲胺磷农药浓度的相关系数分别为0.776、0.881 4、0.710 4和0.981 5；2.5 mL的样品提取液时，B、C、D的抑制率与甲胺磷农药浓度的相关系数分别为1、0.932 7和0.993；从IC10看，6种试剂盒对甲胺磷的敏感性为D>A>C>B；同时各试剂盒对甲胺磷的敏感性在样品提取液用量为3 mL和2.5 mL间有一定的差异，在样品提取液用量为3 mL和2.5 mL时，A、B、C、D试剂盒的IC10分别为0.0824 3 mg/kg、1.622 9 mg/kg、 1.199 6 mg/kg、0.047 57 mg/kg和2.364 8 mg/kg、0.792 9 mg/kg、0.068 27 mg/kg。

从半抑制浓度(IC50)看，在样品提取液用量为3 mL和2.5 mL时，除D试剂盒测定甲胺磷的半抑制浓度为0.480 8 mg/kg和0.647 6 mg/kg外，A、B、C试剂盒测定甲胺磷的半抑制浓度均大于3 mg/kg。

2.3.2 毒死蜱 除A试剂盒外，其他5种试剂盒测定毒死蜱的抑制率和农药浓度间呈较好的线性关系，3 mL的样品提取液和2.5 mL的样品提取液的毒死蜱抑制率和毒死蜱浓度的相关系数分别为0.925 4、1、0.805 5、0.809、0.631 2和0.971 5、1、0.912 2、0.765 9、0.966 6；从IC10看，3 mL和2.5 mL的样品提取液取进行测定，5种试剂盒对毒死蜱的敏感性均为D>C>E>B>F，且各试剂盒间存在较大差异，如C和D间存在数量级上的差异；各试剂盒对毒死蜱的敏感性3 mL和2.5 mL的样品提取液取用量测定存在较大差异，如D试剂盒3 mL和2.5 mL的样品提取液计算的IC10结果存在数量级上的差异。

从半抑制浓度(IC50)看，在样品提取液用量为3 mL和2.5 mL时，除D和C试剂盒测定毒死蜱的半抑制浓度为1.2365×10-3mg/kg、0.048 16 mg/kg和0.011 84 mg/kg、0.075 27 mg/kg外，B、E、F试剂盒测定甲胺磷的半抑制浓度均大于6 mg/kg。

2.3.3 甲基对硫磷 6种试剂盒中A、B、C测定甲基对硫磷分抑制率和农药浓度间无线性关系，F试剂盒对甲基对硫磷不敏感， 3 mL和2.5 mL的样品提取液，在5个浓度水平下抑制率均为0。从IC10看，D和E对甲基对硫磷的敏感性在样品提取液用量为3 mL时，为D>E，在提取液用量为2.5 mL时，为E>D。

从半抑制浓度(IC50)看，仅D和E试剂盒测定甲基对硫磷的半抑制浓度均大于10 mg/kg。

2.3.4 三唑磷 6种试剂盒中A试剂盒测定三唑磷抑制率和农药浓度间无线性关系；B试剂盒对三唑磷不敏感， 3 mL和2.5 mL的样品提取液，在5个浓度水平下抑制率均为0；C、D、E、F试剂盒测定三唑磷的抑制率和农药浓度间均存在较好的线性关系，在样品提取液用量为3 mL和2.5 mL时，C、D、E、F试剂盒测定的抑制率和三唑磷浓度的相关系数分别为0.858、0.812 4、0.867 5、0.683 2和0.835 2、0.901 4、0.843 5、0.607 5；从IC10看，在样品提取液取用量为3 mL和2.5 mL时，C、D、E、F试剂盒对三唑磷的敏感性性均为C>E>D>F，各试剂盒对三唑磷的敏感性在3 mL和2.5 mL的样品提取液取用量间差异较小。

但是从半抑制浓度(IC50)看，C和E试剂盒测定三唑磷的半抑制浓度较低，在样品提取液用量为3 mL和2.5 mL时，其半抑制浓度分别为0.883 7 mg/kg、0.960 3 mg/kg和1.449 1 mg/kg、1.369 6 mg/kg外，D、F试剂盒测定三唑磷，在样品提取液取用量为3 mL和2.5 mL时的半抑制浓度均大于3 mg/kg。

3 结论与讨论

研究结果表明， 6种试剂盒对4种农药的灵敏度均不同，测试时取用3 mL的提取液和取用2.5 mL的提取液根据农药的不同和试剂盒的不同存在一定差异。6种试剂盒测定甲胺磷、毒死蜱、甲基对硫磷、和三唑磷的半抑制浓度均大于3 mg/kg，大于国家限量标准的规定(甲胺磷0.1 mg/kg、毒死蜱1 mg/kg、甲基对硫磷0.02 mg/kg、三唑磷0.1 mg/kg)，建议在实际的检测工作中对抑制率≥10%的样品进行复检，同时上色谱质谱进行定性定量。

6种试剂盒对4种农药的敏感性均不相同，这可能是跟各试剂盒所选用的酶的来源不同有关，也可能跟各试剂盒中所选用的酶的提取的方法或者酶的纯度不同有关系。从IC50看，多数试剂盒测定甲胺磷、毒死蜱、甲基对硫磷和三唑磷的半抑制浓度均大于3 mg/kg，和国家限量标准[19]进行比较，多数酶抑制法快速检测试剂盒测定甲基对硫磷、三唑磷和甲胺磷已经失去意义。在日常检测工作中，由于待测样品中不仅农药的品种未知，农药的含量也未知，根据各试剂盒测定4种农药的检出限看，多数试剂盒测定4种农药的检出限(IC10)已超过国家标准，故建议在用商品化酶抑制-比色法快速检测试剂盒进行果蔬中农药残留的筛查时对于抑制率大于10%的样品进行复检，同时借助色谱及质谱进行定性定量分析。

有学者认为酶试剂易失活，导致反应不稳定，检测结果误差较大，重复性不好，实际应用中的确认率仅为60%～70%，仅适用于现场定性和半定量检测[20]，而笔者认为,酶试剂容易失活是因为受外界的影响较大，因为其对有些农药极为敏感，比如有些酶对敌敌畏、敌百虫[11]和毒死蜱等农药的敏感性极强，空气中的这些农药分子都有可能导致酶失去活性，但是商品化快速检测试剂盒中的酶试剂的稳定性还是比较好的，配制好的酶在合适的温度条件下存放较长的时间依然具有活性[9-11]，而且酶抑制-比色法快速检测农药残留的方法是一种非定性也非定量的方法[18]。国家标准[13]和行业标准[21]中对于酶抑制法快速检测农药残留的方法的超标样品的判定设置了不同的标准，分别为≥50%或≥70%为超标样品，如果样品中含有甲胺磷和甲基对硫磷等国家禁用的农药，即使抑制率小于50%或70%，按国家限量[19]标准判定，该样品依然为不合格样品。尽管酶抑制-比色法快速检测技术已经成为国内外快速检测农药残留的主流技术，也是现阶段比较合理的选择方案之一[2]，但笔者认为该技术是否合理还有待于广大科研工作者进一步研究。