窦晓丽，胡文静，刘 凡，林彩英，李克梅

(1.新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052；2.昌吉农业技术推广中心，新疆昌吉 831100)

0 引 言

【研究意义】苜蓿产量高、品质优，因其具有强大的固氮和恢复植被、保持水土能力，常用于改良土壤，恢复生态，在新疆被广泛种植[1，2]。调查新疆苜蓿病害时发现了2种症状不同的叶斑病，经过对病原菌分离、致病性测定，病原鉴定系列研究，确定为由苜蓿茎点霉(Phomamedicaginis)和囊状匍柄霉(Stemphyliumvesicarium)引起的苜蓿茎点霉叶斑病及苜蓿匍柄霉叶斑病[3，4]。研究分析这2种病原菌的生物学特性，为研究该病害的发生规律、抗病品种选育及综合防控提供理论依据。【前人研究进展】苜蓿茎点霉叶斑病，又称春季黑茎病或者轮纹病，是一种毁灭性病害，在欧洲、美洲广泛分布[5，6]，非洲也有报道[7]；在我国甘肃、吉林、陕西等地均有发生[8-10]。严重发生时，苜蓿叶片提早脱落，造成干草、种子减产，种子发芽率和千粒重降低，严重影响牧草质量[11]。Chung等[12]研究了不同温度、光照等条件对苜蓿茎点霉生长的影响，发现分生孢子器和分生孢子形成的最适温度为30和20℃，持续光照有利于其生长。张丽[9]研究表明，苜蓿茎点霉吉林菌株最适生长条件为20℃、V8培养基、全光照、蔗糖和牛肉膏上生长最佳，菌丝致死温度为50℃。李洪建[10]研究发现，苜蓿茎点霉陕西菌株最适生长条件为25℃、pH值为7、淀粉和牛肉膏为最佳碳源和氮源。苜蓿匍柄霉叶斑病是地理分布极为广泛的一种苜蓿病害，发现于美国，在加拿大、德国、波兰、新西兰等多国均有此病发生，我国吉林、黑龙江、江苏、甘肃、宁夏、新疆、陕西等省(区)发现该病[11-14]。苜蓿匍柄霉叶斑病影响苜蓿的生长，造成落叶、种子减产、发芽率降低、严重影响牧草产量和品质[8]。引起苜蓿匍柄霉叶斑病的病原菌有匍柄霉(Stemphyliumbotryosum)、枯叶匍柄霉(S.herbarum)、紫花苜蓿匍柄霉(S.alfalfa)、球孢匍柄霉(S.globuliferum)和囊状匍柄霉(S.vesicarium)、束状匍柄霉(S.saciniiform)[8，15]。由囊状匍柄霉引起的苜蓿匍柄霉叶斑病在非洲南部、阿根廷曾被报道[17，18]，在我国尚未见报道。王雪薇等[15]认为新疆南疆地区发生的苜蓿匍柄霉叶斑病病原菌为束状匍柄霉。针对苜蓿匍柄霉叶斑病，张静妮[19]研究发现，最适合匍柄霉菌丝生长及产孢的培养基是V8培养基，最适温度为25℃，苜蓿品种公农1号、庆阳、BL-201对苜蓿匍柄霉叶斑病抗性最好；黄宁[20]选用44个苜蓿材料对匍柄霉叶斑病进行了抗病评价及抗性评价标准对照品种筛选，得到抗病品种15份、中抗病品种22份、感病品种7份，筛选出抗病对照品种为皇冠，中抗病对照品种为新牧1号，感病对照品种为赛特。【本研究切入点】关于苜蓿茎点霉和囊状匍柄霉新疆种群的生物学特性尚未见系统报道。苜蓿茎点霉叶斑病和匍柄霉叶斑病在新疆仅有发生报道，但是对其病原菌的分类地位、病害发生规律、病原菌生物学特性均缺少明确描述。研究不同培养基、温度、不同碳源、氮源等对苜蓿茎点霉和囊状匍柄霉菌丝生长的影响。【拟解决的关键问题】在不同培养基、温度、碳源、氮源条件下，培养P.medicaginis(代表菌株PM-1)7 d，培养S.vesicarium(代表菌株SV-1)5 d，观察菌落及菌丝生长状况，用十字交叉法分别测量这2种病原菌菌落直径大小，采用SPSS 20.0软件分析各处理间的差异，分析其生物学特性，掌握病原菌最适培养条件。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试病株

供试病菌苜蓿茎点霉(代表菌株PM-1)及囊状匍柄霉(代表菌株SV-1)由该实验室分离鉴定保存。

1.1.2 供试培养基

供试11种培养基，包括PDA、PCA、SA、GPA、MA、YEA、OMA、CA、PSA、CMA、Czapek，按照方中达[21]植病研究法配置培养基，灭菌后常温保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 不同培养基对菌丝生长的影响

无菌条件下，在苜蓿茎点霉(25℃生长7 d)和囊状匍柄霉(25℃生长5 d)菌落边缘分别取5 mm菌饼，将菌饼正面朝下分别放于11种不同供试平板培养基中央(培养皿直径75 mm)，25℃恒温培养，每处理3次重复，苜蓿茎点霉生长7 d、囊状匍柄霉生长5 d，用十字交叉法测量菌落直径，观察菌落形态[22]，下同。

1.2.2 不同温度对菌丝生长的影响

分别对2种病原菌进行打孔、接种，将菌饼接种至PDA培养基中央，在5、10、15、20、25、30和35℃下恒温培养，每处理3次重复，十字交叉法测量菌落直径。

1.2.3 不同光照对菌丝生长的影响

对2种病原菌进行打孔、接种，分别置于24 h持续光照、12 h光暗交替、24 h持续黑暗，25℃恒温培养，每处理3次重复，十字交叉法测量菌落直径。

1.2.4 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响

将PDA培养基作为基础培养基，按照葡萄糖的量，分别称取等量的麦芽糖、L-脯氨酸、淀粉、甘露糖、D-木糖、菊糖、山梨醇进行置换，配置成8种培养基。分别对2种病原菌进行打孔、接种并测量。

1.2.5 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响

以PDA为基础培养基，按照2 g尿素的量，分别加入牛肉膏、硝酸钾、硫酸铵、蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸钠、磷酸二氢铵、草酸铵、尿素、L-谷氨酰胺、酵母膏进行等量置换，配成11种培养基。分别对2种病原菌进行打孔、接种并测量。

1.2.6 菌丝致死温度测定

取5 mL无菌水管预热至40、45、50、55、60和65℃，待温度恒定时，分别将打取的2种病原菌菌饼放入试管中摇匀，再对应置于上述温度的水浴锅中，恒温处理10 min，取出试管后迅速冷却，接种并测量。

1.3 数据处理

采用统计软件SPSS 20.0对所测数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对菌丝生长的影响

2种病原菌在供试的11种培养基上均能生长，且存在显著差异，在大多数培养基上生长良好。苜蓿茎点霉在PSA、GPA培养基上生长最快，菌落直径分别为48.33、48.67 mm；在PSA培养基上气生菌丝长而疏松，GPA培养基上菌丝较短且致密。囊状匍柄霉在GPA培养基上菌丝生长最快，菌落直径为54.67 mm；其次为PSA、PDA培养基，菌落直径均为53.33 mm。图1

注：不同小写字母间差异显著(P<0.05)

2.2 不同温度对菌丝生长的影响

2种病原菌在不同温度下菌丝生长存在显著差异，其生长趋势随温度的变化基本一致，在20～25℃时生长较为适宜，最适温度为25℃。苜蓿茎点霉在35℃时不生长，但囊状匍柄霉仍可缓慢生长。图2

图2 不同温度下苜蓿茎点霉和囊状匍柄霉菌丝生长变化

2.3 不同光照对菌丝生长的影响

研究表明，在3种不同光照处理下，苜蓿茎点霉的菌丝生长存在显著差异，24 h持续光照菌丝生长最快，24 h持续黑暗菌丝生长最慢，持续光照条件下更适合苜蓿茎点霉生长。不同光照处理对囊状匍柄霉生长影响差异不显著。图3

注：不同小写字母间差异显著(P<0.05)

2.4 不同碳源对菌丝生长的影响

研究表明，2种病原菌在8种碳源条件下均可生长，且存在显著差异。苜蓿茎点霉在含麦芽糖、葡萄糖、L-脯氨酸的培养基上菌丝生长最佳，菌落直径分别为44、42.67 和41.50 mm；在含甘露糖的培养基上菌丝生长最差，菌落直径仅为27.33 mm。囊状匍柄霉在含菊糖的培养基上菌丝生长最佳，菌落直径为52.83 mm；葡萄糖、L-脯氨酸次之，菌落直径分别为51.33、50.17 mm；在含麦芽糖的培养基上菌丝生长最差，菌落直径仅为27.50 mm。图4

注：不同小写字母间差异显著(P<0.05)

2.5 不同氮源对菌丝生长的影响

2种病原菌在11种氮源条件下均可生长，且存在显著差异。苜蓿茎点霉在含L-谷氨酰胺的培养基上菌丝生长最佳，菌落直径为44.33 mm；尿素次之，菌落直径为35.33 mm；硫酸铵最差，菌落直径仅为18.00 mm。囊状匍柄霉在含L-谷氨酰胺的培养基上菌丝生长最佳，菌落直径为51.83 mm；胰蛋白胨次之，菌落直径为49.67 mm，磷酸二氢铵最差，菌落直径仅为20.33 mm。图5

注：图中不同小写字母间差异显著(P<0.05)

2.6 病菌致死温度

研究表明，2种病原菌菌丝在40～65℃处理后，菌丝生长存在显著差异。苜蓿茎点霉在处理温度≥55℃时，菌丝不生长，故其致死温度为55℃。囊状匍柄霉在处理温度≥60℃时，菌丝不生长，故其致死温度为60℃。图6

图6 不同水浴温度处理下菌丝生长变化

3 讨 论

苜蓿茎点霉和苜蓿匍柄霉叶斑病在新疆苜蓿种植区普遍发生，在准确鉴定病原菌的基础上，对2种病原菌的生物学特性进行研究，摸清2种病原菌的最适生长条件，为该病害的防治研究提供理论依据。研究表明，苜蓿茎点霉新疆菌株最适生长温度为25、30℃时菌丝生长明显开始受到抑制，与李洪建[10]的研究结果一致；全光照有利于该菌生长，与张丽[9]的研究相符。苜蓿茎点霉的最适培养基为GPA、PSA培养基，最适碳、氮源分别为麦芽糖和L-谷氨酰胺，这与张丽、李洪建[9，10]的研究结果存在一定差异，可能是采用的培养基、碳源、氮源等培养条件不全相同造成的。囊状匍柄霉新疆菌株的最适温度生长为25℃，这与陆训[23]对引起莴苣叶斑病的囊状匍柄霉研究结果一致；光照对其无显著影响，说明囊状匍柄霉对光照的需求不严格，这与张志强[24]对引起大蒜叶枯病的囊状匍柄霉研究结果一致。温度升至30℃时，2种病原菌菌丝生长缓慢，35℃时，苜蓿茎点霉的菌丝不再生长而囊状匍柄霉的菌丝仍可缓慢生长，苜蓿茎点霉对高温的忍耐力弱于囊状匍柄霉，这与7月以后调查采样时未发现苜蓿茎点霉叶斑病而正是苜蓿匍柄霉叶斑高发期相吻合。氮源硫酸铵对苜蓿茎点霉抑制作用显著，磷酸二氢铵对囊状匍柄霉抑制作用显著，根据这一结果下一步可以考虑在生产中通过适量增施硫酸铵和磷酸二氢铵，研究其对这2种病害的抗性效应。

4 结 论

2种病原菌在不同培养基、温度、碳氮源下均具有一定的适生性。苜蓿茎点霉(代表菌株PM-1)的最适温度、培养基、碳氮源分别为25℃、GPA和PSA培养基、麦芽糖和L-谷氨酰胺，致死温度为55℃，24 h持续光照有利于该菌生长。囊状匍柄霉(代表菌株SV-1)的最适温度、培养基、碳氮源分别为25℃、GPA培养基、菊糖和L-谷氨酰胺，致死温度为60℃，不同光照处理对该菌丝生长差异不显著。