苏木雅 杜华 师迎旭

CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）是一类具有免疫抑制功能的CD4+T细胞，分为天然产生的自然调节性T细胞和诱导产生的适应性调节性T细胞，在维持免疫稳态方面起着关键作用，异常表达能够导致自身免疫性疾病的发生[1]。最初Sakaguchi等人于1995年研究发现成年鼠中约10%的外周CD4+T细胞表达IL-2受体α链CD25。删除这群细胞后小鼠会自发产生多种自身免疫性疾病，然而将这一类细胞回输后则能够有效的阻止疾病的发生发展。因此将这群细胞被命名为CD4+CD25+调节性T细胞-Tregs[2]。有很多研究显示，Tregs的异常功能与系统性红斑狼疮（SLE），类风湿性关节炎（RA）和其他自身免疫性疾病的发病机制有关[3]。且在某些疾病环境中，Tregs表现出可塑性分化的特性，通过转录因子Foxp3的稳定表达或维持表观遗传修饰使Tregs的稳定性变得异常。Tregs的可塑性分化增加了病理条件下免疫环境（尤其是自身免疫性疾病）的复杂性，所以Treg的可塑性和稳定性对于多种自身免疫性疾病预后的影响密切相关[4]。

如何获取稳定性较好的Tregs，是实现并满足临床应用的先决条件。脐血（umbilical cord blood，UCB）中CD4+CD25+Tregs细胞是独立细胞群。研究发现体外经CD3、CD28单克隆抗体联合IL-2刺激培养的脐血CD4+CD25+Tregs细胞比成人外周血有更强的免疫抑制功能，且体外扩增获得的脐血Tregs细胞在体内存活率高，这意味着UCB 来源Tregs细胞较外周血来源Tregs细胞临床应用价值更高[5]。

材料与方法

1 主要耗材试剂 采集人正常分娩后的脐带血。胎牛血清、RPMI-1640 购自Gibco；青、链霉素购自Invitrogen；无菌离心管50 mL、15 mL、96孔板、5 mL移液管购自Corning；人淋巴细胞分离液、肝素购自上海生工；Treg Expander Beads购自Life Technologies AS；CD4+CD25+Regulatory T Cell isolation Kit 、CD3、CD4、CD25、PI、白介素-2、磁柱购自德国美天妮。主要仪器：Eppendorf 离心机、Thermo二氧化碳培养箱 、生物安全柜、C6流式细胞仪。实验于2016年2月～2017年12月期间在内蒙古医科大学附属医院临床中心实验室完成。

2 实验方法

2.1 脐血单个核细胞的获取：实验所要用的工具都应灭菌消毒。提前在无菌50 mL离心管中加入肝素备用。用无菌离心管收集我院产科正常分娩的足月胎儿的脐带血约50～60 mL。尽快在无菌操作台内用无血清RPMI-1640培养基对脐带血进行2倍稀释。在新的无菌15 mL离心管中加入2 mL人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物公司），将稀释后的血样轻柔的逐滴滴加到淋巴细胞分离液的液面上方，注意操作工程中保持两液面界面清晰。淋巴细胞分离液与抗凝后经稀释全血的体积比例为1∶1，2 000～2 500 r/min室温离心20 min。离心结束后，应可见离心管内液体分三层，底部为红细胞层，中间层是分离液，最上层是血浆/组织匀浆层，血浆层与分离液层之间是一层薄较致密的单个核细胞层，包括淋巴细胞和单核细胞层（图1）。小心吸取单个核细胞层到另一新的无菌离心管内，吸取等体积RPMI-1640稀释单个核细胞，轻柔的颠倒混匀。1 000 r/min室温离心20 min，弃掉上清。再重复用RPMI-1640洗涤细胞1次，细胞计数。

2.2 分离脐血单个核细胞中的Tregs（CD4+CD25+Tregs）：在磁铁中放入分离磁珠柱子，在柱子中加入2 mL生理盐水，任由液体自然流出，润洗柱子，备用。300 g（1 000 r/min）室温离心10 min，弃上清，收集细胞。不必再加入缓冲液，只用管壁内流下的液体，重悬细胞。按照每107个单个核细胞中加入10 μL抗CD4-抗体的量加入适量抗体，4℃标记8 min。按照CD4抗体2倍的量加入免疫分离磁珠，4℃标记8 min。过柱子收集流出液，然后用2 mL生理盐水洗柱子2次，再次收集流出液，细胞计数（约2.88×108）。在磁铁中放入分离磁珠柱子，在柱子中加入2 mL生理盐水，任由液体自然流出，润洗柱子，备用。300 g（1 000 r/min）室温离心10 min，弃上清，收集细胞。不必再加入缓冲液，只用管壁内流下的液体，重悬细胞。按照每107个单个核细胞中加入10 μL抗CD25+抗体的量加入适量抗体，4 ℃标记20 min。标记结束后，加入2 mL生理盐水洗细胞一次。500 μL生理盐水重悬细胞，过磁柱，并用1 mL生理盐水洗3次，弃流出液。取下柱子，置于一个新的15 mL无菌离心管中，用2 mL生理盐水将CD25+细胞冲出，重复一次，细胞计数（约7.38×106）。

2.3 流式细胞术分析Tregs：300 g（1 000 r/min）室温离心10 min，弃上清，收集细胞。不必再加入缓冲液，只用管壁内流下的液体，重悬细胞。分为五份，一份做阴性Con，一份单染CD4，一份单染CD25,一份单染CD3，一份复染CD3、CD4与CD25。4℃标记30 min。标记结束后，各加入1 mL生理盐水洗细胞一次。500 μL生理盐水重悬细胞，4℃避光。用流式细胞仪分析检测经分离磁珠分离后获得的Tregs。分离获得的细胞，300 g（1 000 r/min）室温离心10 min，弃上清，不必再加入缓冲液，只用管壁内流下的液体，重悬细胞。加入PI（终浓度5 μg/mL），37℃标记1 min。用流式细胞仪分析细胞活力。

2.4 Tregs的增殖培养：将经分离磁珠分离纯化后的CD4+CD25+Tregs种于96孔细胞培养板中, 每孔约5×104个细胞,每孔加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基200 μL，37℃、5% CO2、饱和湿度培养细胞。培养体系内还需添加2 mmol/L谷氨酰胺，25 mmol/L HEPES，50 U/mL青霉素，50 μg/mL链霉素，50 μmol/L 2-巯基乙醇，100 nmol/L的雷帕霉素，400 U/mL IL-2，以及人T细胞扩增磁珠，第一周扩增磁珠数目是细胞数的4倍,之后扩增磁珠数与细胞数的比例为1∶1。在培养的1、3、5、7、9、11天，对不同组的培养细胞进行计数。

结 果

首先使用淋巴细胞分离液分离人脐带血中的单个核细胞，经流式检测脐血CD4+细胞中CD4+CD25+Tregs含量为4.5%，CD4+CD25–细胞含量为95.5%（图1）。进一步采用CD4与CD25免疫分离磁珠分选单个核细胞中的Tregs，通过分选有效地富集了目的细胞，CD4+CD25+Tregs含量为81%（图2）。经PI染色可见分离磁珠分选过程对于Tregs没有明显的损伤作用（图3），细胞活力较好。

将Tregs与人T细胞扩增磁珠共培养后，可见磁珠可以有效的扩增Tregs，而对照组Tregs细胞数则是先增高后降低，不能有效地保持Tregs细胞数量级及活性（图4、图5、表1）。

讨 论

研究发现体内Tregs缺乏或者功能损伤后，机体会产生自身免疫性疾病，如多发性硬化症、类风湿性关节炎、糖尿病、系统性红斑狼疮、重症肌无力等[6-9]。Tregs 尤其抗原特异性的Tregs在治疗自身免疫性疾病疾病中具有良好的发展前景。Anderton与Bykovskaya等体外扩增SLE病人外周血来源的CD4+CD25+Foxp3+CD127lowTregs后，输注至病人体内后，发现病人体内的Tregs数目增长1.5～2倍，并未出现副作用，且降低了病人疾病复发率，有效弥补了病人外周血中Tregs细胞的功能[10，11]。脐血（umbilical cord blood，UCB）中的CD4+CD25+Tregs细胞是一个组成较单一的独立的细胞群，细胞成分主要为CD4+CD25highTregs细胞, 而CD4+CD25lowTregs的细胞数量则相对较少。研究发现脐血中新鲜分离的CD4+CD25+Tregs细胞较成人外周血中分离的CD4+CD25+Tregs细胞的抑制活性弱，然而研究发现体外经CD3、CD28单克隆抗体联合IL-2刺激培养的脐血CD4+CD25+Tregs细胞比成人外周血有更强的免疫抑制功能，且体外扩增获得的脐血Tregs细胞在体内存活率高，这意味着UCB来源Tregs细胞较外周血来源Tregs细胞临床应用价值更高[12，13]。传统Tregs细胞体外扩增多使用磁珠分选获得纯度较高的Tregs细胞后，添加IL-2、IL-15、IL-33等细胞因子，并添加anti-CD3/CD28磁珠刺激增殖[14-16]。虽然Tregs体外扩增倍数较高，但是传统Tregs体外扩增方法成本较高，且生物安全性有待考究。因此，建立成本低、生物安全性的Treg体外扩增方法，才能满足大量的临床输注需要。虽然通过实验可见免疫磁珠确实能够很有效的在体外扩增调节性T细胞，但其生物学能力的评估仍需要进一步的研究证实。

表1 Tregs扩增磁珠体外促人T细胞的数量变化情况

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突