肖 琳，陈 中

(华南理工大学食品科学与工程学院，广州 510640)

芽孢杆菌在微生物探讨领域有着具大的作用。芽孢杆菌是工业上酶的重要菌种来源，利用芽孢杆菌通过发酵能产生具有高活性、高纯度的淀粉酶、蛋白酶、纤维酶等[1,2]。木质素是一种难降解的无定形芳香化合物，但经鉴定表明，解糖类芽孢杆菌能降解纤维素和半纤维素，并能降解木质素[3]。芽孢杆菌在农作物的杀虫防病和畜牧业上具有广泛的应用[4]，它产生的多种功能代谢产物还具有抑菌和促生效果，还可应用在研究生物保鲜和生物肥料等方面[5]。现在很多饲料会添加益生菌。益生菌种类以芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌为主[6]。芽孢杆菌现已经被应用至医学研究范畴。例如：大量实验证明支气管炎、肠炎等可利用枯草芽孢杆菌活菌剂来治疗。此外，芽孢杆菌还可用于预防和治疗皮肤细菌感染[7]。

本实验采用高温纯水中分离出来的菌株作为目标菌，对其进行鉴定和理化特性研究，对摸索其杀灭方式及对后续进行监控具有一定的参考价值，也为开发此菌在各领域的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要设备

分析天平/电子天平，振荡器，恒温培养箱，生物安全柜(博科生物生产)，超净工作台，冰箱，生物显微镜，紫外分光光度计，高压蒸汽灭菌器，pH计，过滤器，恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司生产)。

1.1.2 试剂与培养基

R2A琼脂培养基、TSA胰蛋白胨大豆琼脂、LB培养基、MC 麦康凯琼脂培养基(均为广州市环凯生物科技有限公司生产)。氧化酶试剂(生物梅里埃公司生产)，氯化钠(广州化学试剂厂生产)，API20E、API20NE、API50CH(生物梅里埃公司生产)，细菌基因组DNA快速提取试剂盒(广东东盛生物科技公司生产)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的采集、复苏与保存

纯化水按药典方法采用薄膜过滤法收集，通过R2A培养基培养，TSA液体培养基中复苏，划板于TSA固体培养基平上，得到目标菌种。

1.2.2 细菌形态观察

选取营养琼脂平板上的24 h的新鲜菌落进行革兰氏染色[8]和芽孢染色[9],于显微镜下观察菌落的形态。

1.2.3 生理生化鉴定

A.运动性[10]。

利用穿刺法蘸取新鲜菌落于斜面培养基上，放置于35℃培养箱中培养24～48 h再观察。如在培养基内向边缘扩散，则表示有运动性。

B.氧化酶试验[10]。

将二甲基对苯二胺1%水溶液滴于干净的滤纸上，挑取新鲜菌落于滤纸上，如果在10 s内出现红色为阳性，否则为阴性。

C.AIP20 E、API20NE、API50CH生化试剂盒鉴定进行生化鉴定。

D.16S rDNA鉴定。

DNA提取：参照DNA快速提取试剂盒。

DNA质量检验：用超微量的分光光度计检测 DNA的长度和浓度。

PCR扩增：利用试剂盒对所提取的DNA通过聚合酶链式反应(PCR)用来扩增基因片段[11]。委托广东省微生物研究所完成。

DNA序列的测定：将转化好的菌液以1∶1的体积比加入50%的甘油，送往广州华大基因科技有限公司进行测序，对比分析序列的同源性，确定其最终的种类。

E.体外抑菌试验。

将新鲜培养好的菌悬液于8 000 r/min离心10 min，离心后取上清液浓缩至10 mL，作为待测液。准备五种致病指示菌(大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、内志贺氏菌ATCC25931、乙型副伤寒杆菌CMCC50094)制备成菌悬液并均匀涂抹于LB培养基板上。在培养基平板中间打一小孔，孔内注入100 μL制备好的芽孢杆菌待测液，置于37℃培养箱培养12 h，观察是否有抑菌圈出现[12,13]。

F.生长曲线的绘制。

将新鲜菌株配置成浓度为108 CFU/mL菌悬液作为待测液。在装有100 mL LB液体培养基的锥形瓶。加入2 mL的待测菌悬液，并编号，置于37℃培养箱培养24 h，每隔8 h取出锥形瓶，吸出1 mL菌悬液，用分光光度计测定培养基的OD600(细菌培养液在600 nm处的吸光值，利用吸光值来测量细菌培养液的浓度)。最后，将待测菌各个时间段的菌落OD值绘制成生长曲线[14,15]。

G.耐胆盐性实验。

胆盐的主要成分是钠盐或钾盐，是动物胆汁中参与脂肪消化吸收的重要成分，具有杀菌功能[16]。配制胆盐浓度分别为0.2%、0.5%、1%、2%、5%、8%、10%的LB培养基，接入等量的菌悬液，37℃和恒温培养24 h，设未接菌的空白作对照。

H.耐热性实验。

将活化后的菌悬液分三次接种到LB液体培养基中，37℃培养4 h，将水浴锅温度依次设置为95℃、105℃、115℃。每个温度段分别培养5 min、10 min、15 min和20 min，然后通过无菌操作吸收1 mL用高温处理过的细菌溶液，快速冷却，并在平板上计数。

I.耐酸性实验。

因动物胃酸pH值大概在2.0～6.0，将菌悬液按5%的比例分别接种于不同pH的LB培养基中，培养基用HCl来调节pH值，并置于 37℃培养箱培养，分别2 h、4 h，吸1 mL并用MC培养基培养后计数，重复三次[17-18]。

动态显色法检测4种清热解毒类中药注射液中细菌内毒素含量 …………………………………………… 张军霞等（13）：1806

2 结果与分析

2.1 菌落形态观察

观察在TSA琼脂平板上培养2 h的菌落后发现，菌落蔓延扩散，呈油脂稍透明状，圆形，菌落淡黄色，表面干燥，无固定大小，在营养琼脂上无可溶性色素，如图1。

图1 菌落Fig.1 Colony

2.2 细菌形态观察

革兰氏染色：通过染色将玻片放在40×100倍的显微镜下观察。细菌革兰氏染色阳性、杆状，可见菌体内膨大的芽孢囊。

芽孢染色：在油镜下观察，菌体呈红色，在膨大的胞囊内芽孢呈绿色。

2.3 生理生化鉴定结果

通过运动性实验发现，细菌具有鞭毛，在培养基管内观察其具有一定的运动性。结合细菌的生理生化特性和菌落形态，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，可初步鉴定出该菌株属于解糖类芽孢杆菌属。菌株生理生化鉴定结果见表1。

表1 菌株生理生化鉴定结果Tab.1 Physiological and biochemical identification results of the strain

2.4 16S rDNA鉴定结果

测序引物为1492R和27F。

基因组序列：实验菌株与对照条带比较，可知目标扩增产物的片段长度大约为450 bp，则通过16S rRNA基因序列比对表明，该菌株与解糖类芽孢杆菌关系最密切，并结合生理生化反应结果，将其鉴定为成解糖类芽孢杆菌。

测序结果：中文名为解糖类芽胞杆菌(拉丁名Paenibacillus glucanolyticus)。

2.5 体外抑菌试验结果

通过体外抑菌法进行对常见致病菌五种致病指示菌进行抑菌实验，试验结果如表2，说明解糖类芽孢杆菌对五种常见致病菌均有抑制作用。

表2 解糖类芽孢杆菌抑菌性Tab.2 Bacteriostasis of bacillus amyloliquefaciens

2.6 菌株生长曲线绘制

从实验可知，解糖类芽孢杆菌从培养至16 h后，吸光度OD600显著上升，生长速度较快，进入对数增长期。菌株培养至24 h，OD600到达最高值，24 h后，曲线平缓下降，菌体进入稳定生长期。32 h后，生长速度下降较快，菌体进入衰亡期。故在本实验中，一般选取培养24 h菌龄的菌株为最适合接种菌株。

2.7 耐胆盐性实验结果

由表3可知，该菌株在2%以下盐度的培养基中可生长。解糖类芽孢杆菌可以在低浓度盐溶液中生长，具有一定的耐胆盐性。

表3 耐盐性实验结果Tab.3 Experimental results of salt tolerance

2.8 耐热性实验结果

从图2中可看出，在95℃、105℃、115℃三个不同温度下，加热5 min后，细菌数量没有减少，反而有少量增加，原因可能是时间短，液体传热速度慢，短时高温反而促进孢子萌发。随着加热时间的延长，10 min后下降趋势明显。115℃和105℃热处理20 min后，活菌数减少了2个数量级。95℃热处理20 min后，仅减少了一个数量级。115℃随着加热时间增加，菌落减少较显著，95℃和105℃热处理曲线变化相对平缓，需要较长的加热时间才能杀死相同数量的芽孢杆菌。

图2 菌株耐热曲线Fig.2 The heat resistance curve of strain

2.9 耐酸性实验结果

当初始pH值在2～6时，细菌数量随pH值的变化而变化。当细菌处于强酸环境下(pH值为2和3)生长时，培养基的OD650值在0～14 h内基本不变，约为0.3，说明解糖类芽孢杆菌在强酸性条件下生长性能差。在当初始pH为4时，OD650随时间变化而呈上升趋势，pH接近中性，OD650短时间内接近OD650=1.7的时间越短，这说明，在弱酸性和中性环境下生长速度较快。因此，降低环境pH值的方法可用于抑制解糖类芽孢杆菌的生长。

3 结论

以生产用纯水中分离出来的菌落作为目标菌株，通过生理生化鉴定及经DNA基因测序将菌株鉴定为解糖类芽孢杆菌。进一步对其理化性质进行研究发现，此芽孢杆菌具有一定的抑菌性，可应用到动物饲料加工、食品防腐剂、生物防治等领域[19]。因为动物体内的消化道环境非常复杂，如酸性环境的胃、含有胆盐的肠道以及酶分解等作用，这些均是影响益生菌存活的关键因素。但解糖类芽孢杆菌具有耐酸性、耐胆盐性以及耐高温，利用这些优势，可以将其应用至益生菌中[20]。本实验通过对解糖类芽孢杆菌生理生化特性的初步研究，填补了此菌在这方面资料的空白。

说明该菌抗菌谱较宽，对病原菌有一定的抑菌作用，在生物防治、医药卫生和畜牧业等方面具有应用潜力。