冯庭辉，贾巧君，郭晖，金美艳，陈喜良，刘峰，梁宗锁*

(1.浙江理工大学 生命科学与医药学院，浙江 杭州 310018； 2.新乡学院 生命科学学院，河南 新乡 453000；3.浙江万寿康生物科技有限公司，浙江 武义 321200； 4.陕西步长制药集团公司，陕西 西安 710000)

黄精药材为天门冬科(Asparagaceae Juss.)黄精属(PolygonatumMill.)黄精(PolygonatumsibiricumRed.)的干燥根茎。黄精是传统的药食同源中药[1-2]，味甘、性平、无毒，主要分布于甘肃和陕西，特别是在秦岭地区蕴藏量极大[3]。黄精的药用历史已有2 000多年，其根入药性平而润，味甘而淡，可补中益气、定肝胆、润心肺[4-5]。现代药理学研究发现，黄精具有提高免疫系统功能、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、强心、降血脂等药理作用[6-10]。在我国古代，黄精就被作为“长生不老”和“延年益寿”的药用植物而被使用和认知[11]。

目前，关于黄精化学成分的研究主要集中在多糖上[12]，对黄精多酚的研究报道较少[13-15]。植物多酚具有抗氧化、预防心血管疾病、抗癌、抗菌消炎、抗病毒等作用[16-19]。目前，黄精多酚的提取多以乙醇为溶剂，采用超声波辅助提取的工艺报道较少见[20-21]，且不同研究的黄精多酚得率相差较多:吴其国等[20]研究了安徽不同产地野生与栽培多花黄精的总酚含量，在3.46～5.22 mg·g-1；焦劼等[21]报道不同产地黄精总酚含量呈正态分布。但在本研究范围内，关于黄精总酚提取工艺中各项参数对提取效果的影响尚未见报道。

响应面分析法通过建立数学模型能够精确地计算出各个因素对研究目标的响应值[22]，被越来越多的中药材成分提取优化研究所使用，如解红霞等[23]利用响应面法优化芹叶铁线莲中总皂苷的提取工艺等。本研究在单因素试验基础上，选取温度、超声时间和超声次数3个主要因素，采用响应面分析法，以黄精总酚得率为响应值，对其提取工艺进行优化，以期为黄精多酚的提取研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄精药材，陕西略阳黄精GAP(中药材生产质量管理规范)基地提供，经浙江理工大学生命科学与医药学院浙江次生代谢重点实验室鉴定为天门冬科植物黄精的干燥根茎。

无水乙醇，杭州高晶精细化工有限公司；没食子酸，上海源叶生物科技有限公司；福林酚显色剂，北京索莱宝科技有限公司；Na2CO3，杭州高晶精细化工有限公司。所有分离用有机溶剂均为分析纯。

全自动酶标仪，美国BioTek；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；400g摇摆式高速中药粉碎机，温岭市林大机械有限公司；精密可编程热风循环烘箱，立德泰勀(上海)科学仪器有限公司；纯水仪。

1.2 黄精总酚的提取与测定

精确称取黄精细粉0.5 g于试管中，加入一定量不同体积分数的乙醇，超声(250 W，40 kHz)提取一定时间，离心，分离上清液与底部黄精粉，在剩余黄精粉中加入70%(体积分数)乙醇，进行下一次超声提取。反复提取3次，合并滤液。准确吸取40 μL，依次加入3.2 mL蒸馏水、200 μL福林酚显色剂，充分振荡后静置6～8 min，加入500 μL 15%(质量分数)Na2CO3溶液，摇匀后在室温下避光放置，反应2 h，在765 nm波长处测定吸光值。

1.3 单因素试验设计

1.3.1 料液比对提取率的影响

在乙醇体积分数为70%、提取温度为30 ℃、超声30 min、超声次数为3次的条件下，将料液比分别设定为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，探索料液比对黄精总酚提取率的影响。

1.3.2 乙醇体积分数对提取率的影响

在提取温度为30 ℃、料液比为1∶50、超声30 min、超声次数为3次的条件下，将乙醇体积分数分别设定为40%、50%、60%、70%、80%、90%，探索乙醇体积分数对黄精总酚提取率的影响。

1.3.3 提取温度对提取率的影响

在料液比为1∶50、乙醇体积分数为70%、超声时间为30 min、超声次数为3次的条件下，将提取温度分别设定为20、30、40、50、60 ℃，探索提取温度对黄精总酚提取率的影响。

1.3.4 超声时间对提取率的影响

在超声温度为30 ℃、料液比为1∶50、乙醇体积分数为70%、超声次数为3次的条件下，将超声时间分别设定为20、30、40、50、60 min，探索超声时间对黄精总酚提取率的影响。

1.3.5 超声次数对提取率的影响

在超声温度为30 ℃、料液比为1∶50、乙醇体积分数为70%、超声时间为30 min的条件下，将超声次数分别设定为1、2、3、4、5次，探索超声次数对黄精总酚提取率的影响。

1.4 响应面试验设计

根据中心复合设计原理，结合上述单因素试验结果，以黄精总酚提取率为响应值Y(%)，选取提取温度(X1)、超声次数(X2)、超声时间(X3)这3个影响黄精总酚提取率的主要因素，在单因素试验结果的基础上，开展3因素3水平的响应面分析。各因素3个水平的设计值如下:X1，30 ℃(-1，代表水平，下同)，40 ℃(0)，50 ℃(1)；X2，2次(-1)，3次(0)，4次(1)；X3，20 min(-1)，30 min(0)，40 min(1)。

1.5 数据处理

采用Excel 2010软件进行数据整理，利用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken响应面试验设计和结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对提取率的影响

由图1可知，随着料液比增加，黄精总酚提取率先逐渐增大，当料液比为1∶50时黄精总酚提取率达到最大值，随后黄精总酚的提取率呈下降趋势。因此，选择料液比为1∶50。

图1 料液比对黄精总酚提取率的影响

2.1.2 乙醇体积分数对提取率的影响

由图2可知，当乙醇体积分数由40%增长到70%时，黄精总酚的提取率逐渐升高，且在乙醇体积分数在40%～50%和60%～70%的区间内黄精总酚提取率增长较快，而在50%～60%区间增长较为平缓，当乙醇体积分数为70%时黄精总酚提取率达到最高值。主要原因是，当乙醇体积分数为40%～60%时，提取物表面会出现一层无色透明物质，该物质随着乙醇体积分数的升高而逐渐减少，至70%时无该物质。该物质疑似多糖，阻隔了乙醇与黄精药材的接触，影响了黄精总酚的提取。生产过程中同样会遇到此问题。当乙醇体积分数进一步增大到80%～90%时，黄精总酚提取率逐渐下降。这可能与黄精总酚在不同体积分数乙醇中的溶解度有关。综上，选择乙醇体积分数为70%。

图2 乙醇体积分数对黄精总酚提取率的影响

2.1.3 提取温度对提取率的影响

由图3可知:当提取温度为20～30 ℃时，黄精总酚的提取率较高，且呈上升趋势；当提取温度为30～50 ℃时，黄精总酚的提取率明显下降；当提取温度进一步增加到60 ℃时，黄精总酚的提取率较50 ℃时上升。综上，选择提取温度为30 ℃。

图3 提取温度对黄精总酚提取率的影响

2.1.4 超声时间对提取率的影响

由图4可知:当超声时间为20～30 min时，黄精总酚提取率随超声时间延长而升高，当超声时间为30 min时，黄精总酚提取率最高；当超声时间升至40 min时，黄精总酚提取率大幅下降；当超声时间延长至50～60 min时，黄精总酚提取率有所回升，但仍低于超声时间为20～30 min时的黄精总酚提取率。综上，选择超声时间为30 min。

图4 超声时间对黄精总酚提取率的影响

2.1.5 超声次数对提取率的影响

由图5可知:当超声次数由1次增至3次的过程中，黄精总酚提取率相应增高；当超声次数进一步增加至4～5次时，黄精总酚的提取率并未能进一步增加。可能是因为当超声次数过多时，试验过程中产生的损耗愈明显，造成黄精总酚提取率下降。综上，选择超声次数为3次。

图5 超声次数比对黄精总酚提取率的影响

2.2 黄精总酚提取工艺优化

根据Design-Export 8.0软件进行Box-Behnken试验设计，结果详见表1。

表1 黄精总酚提取的响应面分析方案和结果

根据试验结果，进行回归拟合:

对拟合的模型进行回归分析，结果显示，模型达极显著水平，没有失拟度，决定系数R2=0.996 4，调整值为0.991 7，拟合度较高，预测值与实际值具有较高的相似度，变异系数为2.15%。以上结果说明，用该响应面模型来预测和优化黄精总酚的提取工艺具备可行性。从回归系数的检验值可以看出，各因子对黄精总酚提取率的影响从高到低依次为提取温度(X1)>超声次数(X2)>超声时间(X3)，其中，提取温度的影响达到极显著水平。

响应曲面图可以直观地表示各个试验因素不同水平与响应值的函数关系，比较直观地反映不同因素间的交互关系。等值线图越圆，表明两因素的交互影响越小；等值线图越扁，表明两因素的交互影响越大。由图6～8可知，提取温度与超声次数的斜面最陡，等线图较扁，具有最高点，说明两者交互作用最大；提取温度与超声时间的交互作用次之，其斜面较陡，底部等高线呈椭圆、闭合，有最高点，交互作用明显；超声次数与超声时间的斜面较缓和，但等值线图最扁，且有最高点，说明这两者有较大的交互作用。

图6 提取温度与超声次数对黄精总酚提取率的影响

图7 提取温度与超声时间对黄精总酚提取率的影响

图8 超声次数与超声时间对黄精总酚提取率的影响

通过软件Design-Expert 8.0.6求解方程，得出最优提取工艺条件:提取温度为37.48 ℃，超声次数为2.81 次，超声时间为29.88 min，此时黄精总酚的提取率可达6.860 69 mg·g-1。

为提高黄精总酚的提取率，考虑到实际生产加工操作和节能需求，将黄精总酚的提取工艺条件优化为提取温度37 ℃、超声次数3次、超声时间30 min。经3次重复验证，此条件下黄精总酚的提取率为7.003 35 mg·g-1，与理论预测值基本吻合，比单因素试验下的最高提取率高出0.399 mg·g-1。

3 小结

本研究在单因素试验的基础上，选出对黄精总酚提取率影响较大的3个因素，并通过Box-Benhnken响应面法优化了超声辅助提取黄精总酚的工艺参数:料液比为1∶50，乙醇体积分数为70%，提取温度为37 ℃，超声次数为3次，超声时间为30 min。在此条件下，黄精总酚的提取率可达7.003 35 mg·g-1。