顾 娴，李晓敏，王国栋，张晓琳，窦晓利*

（1.甘肃省农业科学院 畜草与绿色农业研究所，甘肃 兰州 730070；2.中粮营养健康研究院有限公司，北京 102209）

青贮玉米是将整株玉米或者玉米秸秆在未完全成熟的时候收割，切成小段，用青贮装置隔绝空气密封发酵后做成的青贮饲料，在饲喂牲畜方面有着重要的意义[1]。青贮后的作物秸秆具有适口性好、容易消化等特点，青贮发酵过程中还会产生许多蛋白质、氨基酸等影响物质，并且有效抑制有害霉病菌，既能提高牲畜肉的品质，还能降低牲畜患病概率[2]；青贮饲料对原料没有严格要求，各种作物的秸秆都可以制作。乳酸菌在青贮发酵过程中起到最重要作用的微生物，原料附着的乳酸菌直接影响青贮的品质[3]。我国北方地区是青贮玉米生产的重要产区，不同地区自然条件发酵的青贮品质各不相同，二次发酵的程度也各不相同，说明其中所含的乳酸菌菌种有着一定的差别。挖掘不同地区的乳酸菌种质资源，从中筛选出优质的适合生产青贮的乳酸菌菌种，对青贮饲料的生产有着重要的意义。

1 材料与方法

1.1 青贮饲料样品

通过亲自采样以及样品寄送的方法，收集了涵盖我国北方大部分地区的青贮玉米的47个样品，其中甘肃省17个，内蒙古自治区14个，东北地区3个，山东省6个，河南省3个，北京、天津和河北地区共4个。取样时去掉表面和空气接触的部分，从深处取样，样品立刻用真空包装机分装2～3袋，每袋200～300 g，用冰盒保存，一袋保存于4°冰箱，用作乳酸菌筛选，一袋在-80°冷冻后，测定其中微生物多样性，剩下一袋保存在-80°冰箱中备用[4]。

1.2 乳酸菌的分离和筛选

每个样品称取10 g，加入250 ml无菌水中，放入均质袋，与均质机上均质10 min，用无菌纱布过滤，滤液倒入灭菌的锥形瓶中迅速封口。在厌氧操作台进行以下操作：用无菌生理盐水进行梯度稀释；每个样品选取2个合适的梯度，每个梯度2个平行；涂布在MRS平板培养基上，37℃厌氧培养箱中培养24～48 h[5]。根据菌落的大小、颜色、形状、光泽度等选择不同单菌落，在MRS平板培养基上三区划线接种，在厌氧培养箱中过夜培养。重读划线3次纯化培养，得到单一菌株。挑取纯化后的单菌落于液体培养基接种于试管中，同等条件下富集培养，取500 μl与等体积50%甘油混合，保存于速冻管中，于-80°冰箱保存。保种后的菌株再挑取菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察其菌体大小、形状和排列方式[6]。

1.3 乳酸菌的鉴定

采用16S rRNA基因序列进行乳酸菌的鉴定。分离的乳酸菌株在平板MRS培养基上过夜培养，挑取单独菌落，混入装有20 μl无菌水的EP管，热激1～2 min，然后振荡离心后静置。取上清液作为DNA模板，进行16 S rRNA的扩增。引物序列为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和14892R：5′-TACCTTGTTACGACT，由大连生物公司合成，扩增序列长度大约为1 500 bp。25 μl体的PCR反应体系包括：10×buffe2.5μl，dNTP2.0μl，MgCl2.0μl，正向、反向引物各1.0 μl ，DNA模板2.0 μl，Tag酶0.3 μl，无菌水14.2 μl。PCR扩增程序：预变性，95℃，2 min；变性，95℃，30 s；退火，55℃，30 s；延伸，72℃，3 min；延伸，72 ℃，10 min；保存，4℃。PCR扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测，如果在紫外灯下可见1 500 bp左右的条件[7]，则扩增成功，产物送北京生物公司进行测序。

2 数据分析

利用BLAST 将所测定的菌株的16S rRNA序列与GenBank里面的已知细菌的序列进行比对，寻找与目的基因同源性最高的已知分类地位的菌种，可得知所鉴定的菌株的分类地位[8]。

2.1 菌粉制作

选择3株具有代表性的菌株：WW1-1（L.P）、DHL-9（W.）、BY1-1（A.P），通过菌株的复壮，转接扩大培养，接种发酵罐过夜发酵的步骤获得发酵液，离心后得到菌泥。菌泥加2倍甘油，加100 g脱脂奶粉，搅拌混匀后铺在玻璃平板，用锡箔纸包好，先在-80℃冰箱预冻2～4 h，然后在冻干机上冷冻干燥24～48 h，得到3株菌株的菌粉，计数后备用[9]。

2.2 玉米防霉效果试验

使用新鲜玉米粒，水分测定仪测定水分，平衡水分到30%，备用[10]。设计6个处理，具体处理如表1所示。每袋样品100 g玉米，用透明呼吸袋封口后，常温放置发酵。

表1 玉米防霉试验分组

3 结果与分析

3.1 样品的理化性质

收集的47个样品，保存度都基本完好，色泽以青绿色和黄绿色为主，均具有酸香气味，质地松散，不黏手，少数样品有发霉变质情况。均质液的pH值在3.2～5.7之间，基本都为酸性，属于合格的青贮饲料[11]。样品具体信息见表2。

3.2 微生物多样性

在采集的47个青贮样品中择优选择33个样品，通过用真菌引物和细菌引物进行了预试验，检测样品的微生物多样性。结果表明：真菌含量非常少，说明样品几乎没有霉变。在所有样品中多样性最丰富的是厚壁菌门（Firmicutes）；其次为变形菌门（Proteobacteria）如图1所示。多样性最丰富的属乳酸杆菌属（Lactobacillus）和醋酸杆菌属（Acetobacter），如图2所示。

表2 47个玉米青贮样品感官评价与pH值

图1 样品实际结果群落结构组成图（门）

图2 样品实际结果群落结构组成图（属）

3.3 乳酸菌鉴定结果

鉴定结果与微生物多样性检测结果基本一致，典型菌株有植物乳杆菌、布氏乳杆菌、巴氏醋杆菌、魏斯氏球菌等菌种[12]。

典型菌株WW1-1，原料产地为甘肃省武威市，菌落为乳白色圆点，光滑，中间略有凸起，显微镜下菌体形态为短杆状，链接成链；PCR鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus Plantarum）。

典型菌株DHL-9，原料产地为内蒙古自治区呼和浩特市，菌落为乳白色小点，无凸起，光滑，显微镜下菌体形态球形，聚集成团；PCR鉴定为魏斯氏球菌（Weissella）。

典型菌株BY-1，原产地为甘肃省白银市，菌落为浅白色小点，无凸起，显微镜下菌体形态为短杆状，连接成链；PCR鉴定为巴氏醋杆菌（Acetobacter Pasteurianus）。

3.4 防霉试验结果

通过60 d的保存试验，每隔10 d检查每组霉变情况，结果可见前30 d霉变率都比较低，30 d后霉菌大量生长，霉变率出现了不同的变化趋势，除双乙酸钠处理的小组以外，各处理均出现不同程度的涨袋和发霉。防霉效果最好的菌株是 DHL-9（W.），具体结果见表3。

表3 玉米防霉试验结果

4 结语

通过在我国北方大部分地区收集青贮玉米饲料，并对其微生物多样性进行分析，以及对其中乳酸菌进行了分离筛选，选出了具有代表性的若干菌株，制作菌粉，检验其防霉发酵的能力，为以后生产青贮玉米发酵菌剂提供了研究思路和基础数据，具有重要意义。