刘 念，曾添翼，江 凌，黄 和，朱丽英

(1.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800；2.南京工业大学 药学院，江苏 南京 211800；3.南京工业大学 化学与分子工程学院，江苏 南京 211800)

1 海藻糖概述

1.1 海藻糖简介

海藻糖(trehalose)是由两个葡萄糖分子通过α,α-1,1糖苷键连接的非还原性二糖，甜度仅是蔗糖的45%，又称为蕈糖和漏芦糖，是1832年Wiggers首次研究黑麦麦角菌时发现的[1]，在1930年，Bredereck首先利用核磁共振技术阐明了其化学结构[2]。海藻糖有α,α-海藻糖、α,β-海藻糖和β,β-海藻糖3种光学异构体(图1)[3]，其中α,α-海藻糖在自然界中存在最广泛，在细菌、真菌、植物和动物中都可以发现[4]。

图1 海藻糖的异构体

1.2 海藻糖的理化性质

目前在市场上流通的海藻糖商品一般以两种形式存在，一是不含结晶水的无水海藻糖；另一种是含有二分子结晶水的海藻糖晶体，这是目前的主流商品。海藻糖因其独特的结构，相比于葡萄糖和麦芽糖，具有良好的理化性质(表1)[5-6]。

表1 海藻糖、麦芽糖和葡萄糖的理化性质[5-6]

1.3 海藻糖的安全性

2000年10月，美国食品和药物管理局(FDA)授予海藻糖GRAS认证(Generally Recognized as Safe)，批准海藻糖进入美国食品领域[7]；2000年11月，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确认不需要限制海藻糖的日允许摄入量(ADI)；2001年9月，欧盟(EU)批准海藻糖作为新型食品或食品配料进入市场。2007年，我国卫生部批准了9个新资源食品(卫食新准字2007第0003号)；2009年，我国制定了关于海藻糖的国家标准(GB/T2529—2009)，对海藻糖的质量标准进行了标准化管理；2014年，国家卫计委规定海藻糖按照普通食品管理(国卫办食品函〔2014〕351号)；2015年，中国药典在第一批药用辅料标准草案中公布海藻糖作为辅料品种供注射使用。目前，海藻糖的应用已经广泛分布于食品、医药和农业等领域，具有良好的市场前景[8]。

2 海藻糖的生物保护机制

糖类，如麦芽糖、葡萄糖和蔗糖等在蛋白质受脱水破坏时，均能表现出一定的生物保护机制，而海藻糖在所有糖中的保护作用最为显著。这是因为海藻糖在高温、高压、高渗透和干燥失水等恶劣环境下能够稳定细胞膜和蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征，海藻糖不仅可以保护简单的分子，还可以保护复杂的生物体如细菌和病毒等[9]。根据目前对海藻糖的生物保护机制研究，海藻糖对生物大分子的保护作用主要有3种机制，分别为“水替代(water replacement)”机制、“玻璃转换(glassy transformation)”机制和“优先排阻(priority exclusion)”机制[10]。

2.1 “水替代”机制

生物制剂如蛋白质在脱水过程中失活，原因是水分的丢失使蛋白质构象发生改变，各种保持蛋白结构的相互作用力受到破坏，从而使蛋白质变性。多羟基化合物(如海藻糖)可以代替水分子，与蛋白质的表面形成氢键保持其结构的稳定，进而阻止上述这些变化，保护蛋白质的构象和酶活，这种作用称为“水替代”机制学说[7]。Crowe 等[11]认为在干燥或冷冻的条件下，生物体内的蛋白质、核酸和其他大分子的水化膜会消失，而这层水化膜脱落后会导致生物大分子的结构和功能发生不可逆的变化；而当海藻糖存在时，可与生物大分子的不规则极性基团相互作用形成氢键，取代了由水形成的氢键,这使得分子仍保持其原有结构，不丧失活性。

2.2 “玻璃转换”学说机制

海藻糖的独特之处是高温下可以形成稳定的玻璃态。此时，分子的运动变得非常微弱，扩散系数很低，可以在高温下保持稳定，保护蛋白质的高级结构。虽然这个玻璃态是完全干燥的，但可以把生物分子维持在一定状态，使其在再遇水时回到本身的结构，进而起到保护作用。这种作用称为“玻璃转换”机制学说[12]。Colaco 等[13]认为海藻糖水溶液在逐步干燥时，黏度会随着浓度的增加而增大，浓度达到一定高度时，糖液不会形成晶体而是转化或维持在一种玻璃态。这种玻璃态下糖液黏稠使分子间扩散受阻，导致物质干燥变缓，结果使其水分含量增加，从而维持物质在干燥时的稳定性。

2.3 “优先排阻”机制

海藻糖与不稳定的生物制剂可以产生间接作用，蛋白质溶液中添加的海藻糖会被优先排阻在蛋白质附近。Timasheff 等[14]实验证明，海藻糖在溶液中会与蛋白质等生物大分子表面的水分子结合，使得水分子被排除出来。这样会导致蛋白质等生物大分子的溶剂化层半径变小，使得蛋白质等生物大分子的表观体积缩小，分子之间的结构变得更加紧密稳定，能够更好地抵御恶劣环境对蛋白质等生物大分子造成的伤害，进而对生物大分子起到很好的保护作用。这种作用称为“优先排阻”机制学说[15]。

3 海藻糖的生产现状

3.1 海藻糖的制备方法

海藻糖因其独特的生物学活性备受关注，为了获得高纯度的海藻糖产品，对海藻糖的研究越来越深入。目前，主要采用微生物提取法、发酵法和酶合成法等[16]来生产制备海藻糖成品，而酶合成法工艺简单、原料成本低、酶源丰富，为海藻糖的工业化生产提供了发展空间[17-18]。近年来全细胞技术的发展，解决了诸多限制因素，大大降低了海藻糖的生产成本[19]。

3.1.1 微生物提取法

微生物提取法是一种传统的制备工艺，通常以酵母为提取源，通过控制其生长条件，使海藻糖在体内积累，然后采用有机溶剂将海藻糖提取出来。因为酵母菌在对数生长期处于高温、高渗透压和“饥饿”等恶劣环境时，体内的海藻糖会明显增加[20]。Li等[21]通过筛选得到的酵母菌株，可以在热休克和乙醇胁迫下大量合成海藻糖，海藻糖的积累量达到89.1%。目前这种工艺已经非常成熟，然而存在着生产成本过高、提取源受到限制等缺点，限制了海藻糖的大规模工业化生产。

3.1.2 微生物发酵法

微生物发酵法是利用发酵技术生产海藻糖，对发酵液中的海藻糖进行分离和纯化，得到海藻糖的成品。这种工艺的关键是获得高产海藻糖的菌株，可以通过细胞融合和基因工程等手段获得。通过采用高密度发酵法，在发酵结束前，让菌体处于恶劣环境等，可以得到海藻糖含量极高的发酵产物。Zhao等[22]通过对产海藻糖的酵母菌株进行培养条件优化，使得发酵液中的海藻糖质量浓度高达1 072 mg/L。然而这种方法存在一些局限性，如副产物较多、发酵液中成分复杂、物料转化率低等，给海藻糖的提取和精制带来很大的困难，对降低生产成本、推广海藻糖的应用等非常不利。

3.1.3 酶合成法

酶合成法是在海藻糖合成有关酶的作用下，催化底物麦芽糖、葡萄糖或淀粉等转化为海藻糖[23]。1995年，日本林原生化研究所首次在脂肪杆菌(Pimelobactersp.R48)、水生栖热菌(Thermusquatieas)和恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)中获得能够将底物麦芽糖一步转化为海藻糖的酶，称为海藻糖合成酶，开启了海藻糖合成酶应用研究的新篇章[24]。该酶专一性较高，能够只作用于麦芽糖，将麦芽糖的α,α-1,4糖苷键转化为海藻糖的α,α-1,1糖苷键，不需要消耗高能物质，且酶的转化率高，反应原料容易得到、价格低廉，因此这种方法是将海藻糖进行工业化生产的适宜选择[25-26]。

广西大学的黄日波教授团队通过基因工程技术获得了耐辐射异球菌(Deinococcusradiodurans)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)中的TreS基因，通过在重组大肠杆菌中异源表达，使用酶法生产海藻糖获得了一系列的成果[27]。在2001年通过科学技术成果鉴定，2002年开始向产业化转型，开启了我国低成本、产业化生产海藻糖的新篇章。经过实践证明，酶转化法是最具有工业化潜力的方法[28]。

齐鲁工业大学的王瑞明教授主持完成的“海藻糖生产关键技术研发与产业化应用”项目针对国内外市场对海藻糖产品的迫切需求，建立了海藻糖生产的关键技术体系，实现了海藻糖的大规模化生产。该项目以高麦芽糖浆为底物，在固定化海藻糖合成酶或细胞表面展示海藻糖合成酶的催化下，采用一步酶法生产海藻糖的工艺，所制备的固定化酶，连续使用10次后，酶活力保持80%以上[29]；采用多柱循环模拟移动床连续色谱分离纯化海藻糖技术，实现了海藻糖、葡萄糖和麦芽糖的有效分离，所得高纯度海藻糖产品的得率达92%以上，产品质量符合GB/T 23529—2009标准要求[30]。该技术成果在山东福洋生物科技有限公司、保龄宝生物股份有限公司、山东隆大生物工程有限公司等企业推广应用。2013—2015年，应用单位累计实现新增产值6.2亿元，利润1.2亿元，产生了良好的经济与社会效益。

目前，海藻糖的市场需求正在逐步扩大，2010—2016年，全球海藻糖需求量以2～4万t/a的速度增长。在国际上海藻糖的需求量大约是22万t/a，而平均综合生产力只有6～8万t/a，市场处于供不应求的状态。截至2015年，国内仅保鲜市场对海藻糖的需求就有10万t/a，且随着海藻糖的不断宣传和普及，海藻糖的需求量还会不断攀升。现在国内不断有企业加入到海藻糖生产的队伍中，这些企业的背景主要是以粮食或淀粉为原料生产海藻糖，主要有南宁中诺生物工程有限公司、山东福洋生物科技有限公司、梅花生物科技集团股份有限公司等[28,31]。

南宁中诺生物工程有限公司已经实现了海藻糖的大规模化生产，以广西当地廉价的富含支链淀粉的木薯为原料，采用海藻糖合成酶一步催化的方式来进行海藻糖的生产。其中海藻糖合成酶的基因来源于一种嗜热细菌，发酵宿主采用酵母，经过高密度发酵后，酶活能达到60万U/L发酵液，是日本林原生化的4倍，且原料为原产地，成本比日本林原生化低，因此具有很大的市场竞争力。为了将更加“绿色”的海藻糖成品投向市场，该公司调整后的海藻糖价格为98%食品级海藻糖80元/kg、50%食用液体海藻糖30～40元/kg。

山东福洋生物科技有限公司已经实现了海藻糖的工业化生产。其中高效酶法制备海藻糖项目利用高效工业酶制剂建立了新型酶法生产海藻糖的工艺，获得了具有自主知识产权的生产海藻糖的技术，突破国外企业长期垄断的局面。海藻糖转化率可提高到80%以上，较原有的酶法工艺的转化率提高了30%，为企业新增产值5千万元，潜在市场30万t，产值60亿，具有显著的经济效益和社会效益。

梅花生物科技集团股份有限公司于2013年成立了海藻糖研发项目组，开始自主研发以玉米淀粉为原料来生产海藻糖的工艺。经过近2年的研究、测试，目前海藻糖实现技术突破，生产工艺基本成熟。2015年6月中试车间正式推出海藻糖成品，产品各项指标均与日本林原生化齐平，且海藻糖含量都在99%以上。一期产能初定为1 500 t/a，未来将根据市场情况，按照审批程序，逐步实施扩产计划，实现2～3年内完成3～5万t的产能规划，以填补全球海藻糖市场空缺，打响民族品牌。

3.2 海藻糖的酶法合成途径

海藻糖是细胞渗透调节中重要的生物相容性物质，在干旱、高温等恶劣环境中具有对生物膜分子和蛋白质分子显著的保护作用，因此也被称为“化学分子伴侣”。高等植物体内一般不能合成海藻糖，仅有极少数极端耐旱的复苏植物和耐受完全干旱条件的昆虫、酵母和细菌等生物体体内才会发现大量的海藻糖存在[32]。已知的海藻糖合成途径主要有以下5种[3](图2)：TPS-TPP、TreY-TreZ、TreP、TreT和TreS途径，其中TPS-TPP、TreY-TreZ和TreS途径已经被详细研究。

图2 5种主要的海藻糖生物合成途径

3.2.1 以葡萄糖为底物合成海藻糖(TPS-TPP途径)

TPS-TPP途径是分两步完成的反应，第一步，UDP-葡萄糖(UDP-glucose)和葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate)在海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase，TPS)催化下生成中间产物海藻糖-6-磷酸(trehalose-6-phosphate)；第二步，中间产物被海藻糖-6-磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP)水解，进而生成海藻糖[33]。

TPS-TPP途径最早被发现存在于在酵母菌中[34]，在大肠杆菌中被称为OtsAB途径[35]。目前在细菌、真菌和动植物体内都可以通过这种途径合成海藻糖，而真核生物体内的海藻糖是经此途径完成的。但是对于工业应用而言，此途径需要以高能物质尿苷二磷酸(UDP)参与，成本过高，因此难以实现海藻糖的工业化生产。

3.2.2 以麦芽糖精为底物合成海藻糖(TreY-TreZ途径)

TreY-TreZ途径是也分两步完成的反应，不同的是此反应不需要消耗磷酸盐。第一步，底物麦芽糊精(maltodextrin)在麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trehalose synthase，MTSase or TreY)催化下，位于麦芽糊精还原末端的α,α-1,4糖苷键转化为α,α-1,1糖苷键，生成中间产物麦芽寡糖基海藻糖(malto-oligosaccharide trehalose)，麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trehalose trehalohyrolase，MTHase or TreZ)则水解麦芽寡糖基海藻糖中的第二个α,α-1,4糖苷键，从而释放海藻糖[36]。

目前在水生黄杆菌(Flavobacteriumaquatile)、耐辐射奇异球菌(Deinococcusradiodurans)、节杆菌(Arthrobactersp.)和根瘤菌(Rhizobiumsp.)等菌种中都发现了这种途径[37]。该途径是以麦芽糊精为底物，可通过淀粉液化得到，生产成本低，转化效率高，有很强的工业化应用价值。但麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的酶活力较低，是双酶反应的限速因素。

3.2.3 以麦芽糖为底物通过分子内转糖基合成海藻糖(TreS途径)

TreS途径是一步完成的反应，以麦芽糖(maltose)为底物，在海藻糖合成酶(trehalose synthase，简称TreS)作用下，利用分子内的转糖基将α,α-1,4糖苷键转化为α,α-1,1糖苷键，进而直接合成海藻糖[38]。

TreS催化麦芽糖的酶促反应是一种可逆反应，海藻糖合成酶也会把海藻糖转化为麦芽糖，但是生成速率大于分解速率，使得海藻糖不断积累，同时酶促反应中常伴随有少量葡萄糖产生[39]。目前，国内外已经公开报道的最高TreS催化底物的转化率为70%～80%，部分已经应用于实际生产[26,40]。这种途径工艺简单，成本较低，催化过程不需要消耗高能物质，酶的稳定性较好、专一性强，具有极高的工业化应用价值，更加适合于海藻糖的大规模工业化生产。

4 海藻糖的应用前景

由于海藻糖独特的生物学功能和保护机制，不仅显示出对极端环境、pH和美拉德反应的抵抗性，而且具有很高的保水性，能稳定蛋白质的结构和生物膜的完整性，使其在食品、农业、医药和聚合物材料等领域都有着极其广泛的应用。随着对海藻糖研究的不断深入，其应用领域将会不断拓展[41]。

4.1 海藻糖在食品领域的应用

在食品领域，海藻糖可以作为一种新型食品成分添加到糖果、口香糖、巧克力和肉类等食品中[42]。如在含蛋白质丰富的食品中添加海藻糖，可以抑制蛋白质在冷冻、高温和干燥等条件下的变性，有效地保护蛋白质分子的天然结构，使食品的天然风味和质地保持不变[43]；在淀粉食品中加入海藻糖，尤其是烘烤食品，可以明显地抑制淀粉的老化，延长产品的货架期；在鱼类和鱼类食品加工过程中，尤其是加热处理时会产生令人不快的鱼腥味，这种鱼腥味的成分主要是三甲胺，而在加热前添加海藻糖能有效抑制鱼腥味的产生，保持食品良好的风味[44]；海藻糖还可以改善食品的甜质，在月饼、饼干和糕点等食品中加入海藻糖，可以改善食品的甜度，使其具有清爽的口感；此外海藻糖还能抑制油脂类食品中脂肪酸的分解，在保持食品原有的风味上发挥功效[45]。

4.2 海藻糖在农业领域的应用

在农业领域，海藻糖能够稳定生物膜的结构和提高植物在恶劣环境下的抗逆性，对植物具有很好的保护作用。通过基因工程技术，将与海藻糖合成相关的基因片段导入植物中，培育出来的改良物种可以用于培养抗旱、抗寒和抗盐碱型农作物，使得植物的抗逆保护性增强，进而适应更加极端的环境[46-47]。Duan等[48]将假单孢菌(Pseudomonassp.)中海藻糖合成酶的基因片段成功导入植物细胞中，在极端环境中培养植物，与对照组相比，海藻糖在细胞内得到有效积累，植物的抗逆性得到了明显改善。Theerakulp等[49]的研究显示，水稻幼苗在10 mmol/L的海藻糖溶液中浸泡后，可以在胁迫条件下正常生长，维持了叶绿素含量。降低了Na+与K+的比率，有效减轻了对叶绿素的损害，使水稻的发芽和生长更加完善[50]。

4.3 海藻糖在医药领域的应用

在医药领域，海藻糖是良好的保护剂。在极端条件下，蛋白质等生物大分子可以不变性失活，能有效保护抗生素、激素、疫苗和生物制剂等易失活物质的稳定，其衍生物还可用作抗癌剂、抗肿瘤剂等[51]。随着研究的逐步深入，海藻糖在生育力保存中的应用成为一大热点[52]。

海藻糖在神经变性病中的研究也取得了突破性的进展，以帕金森病(Parkinson’s disease，PD)为例[53]，具有神经毒性作用的α-突触核蛋白的聚集是PD的主要病理学特征。Lan等[54]发现用海藻糖处理过的过表达α-突触核蛋白PC12细胞株后，海藻糖可以促进α-突触核蛋白的清除，对其影响主要是通过增强自噬途径。为进一步研究海藻糖对PD的保护作用机制奠定了基础。

4.4 海藻糖在聚合物材料领域的应用

近年来，由糖来源的聚合物材料已经被广泛研究，因为它的可降解性，预计将取代石油衍生的聚合物材料。在聚氨酯(PU)的研究中，由于糖具有类似于多元醇的性质，已被用作原料[55]。然而糖在有机溶液中被还原，产生醛和酮基团，所获得的PU的弹性特性较差。因此，保持聚合物材料弹性性能的同时，选择在溶液中保留羟基的非还原性糖是理想的原料。例如，Kizuka等[56]使用海藻糖作为原料，开发出了具有新功能的聚合物材料—聚氨酯弹性体(PUE)，可用于绝热、震动绝缘的材料和精密仪器的保护箱等。

海藻糖还可以在微球制备过程中作为稳定剂来减少外界因素对抗原的影响，改善疫苗的免疫结果[57]。例如，Jaganathan等[58]通过对比不同浓度的海藻糖对乙肝表面抗原微球的影响，发现1.5%海藻糖可以很好地保持微球的载药率和在包裹和释放过程时的生物活性，使得乙肝表面抗原微球的载药率可以达到(80±5)%，42 d的累积释放度仍然达到90%～92%。

5 结论与展望

目前在实验室和产业化中主要以微生物提取法、发酵法和酶合成法生产海藻糖，其中以麦芽糖为底物、在海藻糖合成酶的催化下一步合成海藻糖因方法简单、成本低和催化过程不需消耗高能物质等优点备受青睐。然而该酶有温度和pH耐受性差等缺点，因此需要进一步研究海藻糖合成酶的结构和功能。目前，对海藻糖合成酶的代谢机制和三维结构研究是该领域的热点问题，通过结构生物学的方法对酶的三维晶体结构进行解析，根据结构信息和催化位点分析，找出海藻糖合成酶的催化机制，进而结合分子生物学对酶进行改造。随着现代科学技术的发展，研究出先进的仪器和配套的相关软件进行分析也是促进海藻糖发展的一种形式。同时还需要对合成海藻糖的相关菌株进行研究，培育出海藻糖产量高的安全菌株，因为目前大多是在大肠杆菌中进行的，存在着食品安全风险。

海藻糖因为其独特的结构和生物学保护机制，成为了近年来研究的热点，其在食品、农业和医药等领域都有着广泛的应用。随着科学技术的不断发展，海藻糖的研究将会更加明确，其应用领域也将会不断扩展。