CRISPR/Cas9基因编辑工具自2012年问世以来，在生物学领域引发了一场新的技术革命。利用预先设计的多个不同的导向RNA，Cas9能够在基因组的多个不同位置处精准且高效地产生DNA双链断裂。在高等真核生物（植物、动物等）细胞中，这些DNA双链断裂主要通过NHEJ（非同源末端连接）的方式修复，其結果多为小片段的插入和删除（Indels）。如果这些小片段的插入和删除发生在基因的编码区，就会高效地产生移码突变，大概率地导致基因功能的丧失，因此CRISPR/Cas9又被广泛地称为“基因敲除”工具。

除了基因敲除，碱基替换（例如单氨基酸突变相关疾病或性状）是基因编辑领域中另一重要的应用领域。但是，长期以来学界普遍认为，仅仅依靠Cas9的DNA切割功能及细胞自发的NHEJ修复无法进行碱基替换。

要实现碱基替换，目前有以下几种技术路线。1）将含有突变的DNA模板整合在Cas9的切口处，2）单碱基编辑器，例如CBE（C到T的碱基替换）、ABE（A到G的碱基替换）等将脱氨酶与Cas9融合来实现碱基编辑，以及3）PE（prime editing）工具，利用RNA作为反转录的模板，与融合在Cas9（H840A）上的反转录酶配合实现碱基替换。但是，这些工具还或多或少的存在着效率低、脱靶风险高等问题。此外，在一些国家的监管政策中，以上三种方法产生的碱基替换产品会被列入转基因监管，极大地限制了它的产业应用潜力。

2020年9月21日，Science China Life Sciences在线发表了题为“Programmed sequential cutting endows Cas9 versatile base substitution capability in plants”的文章，提出了一种只依靠普通Cas9进行碱基替换的方法。这种新的碱基编辑方法被命名为Cas9-mediated Sequential Editing（CSE），中文名为”循环打靶碱基编辑方案“。

其原理如下：

在高等真核生物（植物、动物等）细胞中，NHEJ的修复往往造成小片段的插入和删除（Indels），并且，其中最常见的是+1/-1bp的类型。作者根据这一现象提出，如果第一次修复成-1bp的类型，针对这一修复成的新序列设计特异的sgRNA，引导Cas9对其进行第二次切割，那么第二次的NHEJ修复就有可能插入一个不同的新碱基，这样就实现了任意的碱基替换。令人意外的是，这种简单的碱基编辑策略目前未见任何相关报道。

作者在拟南芥ALS基因的S653及W574位点，水稻的ACCase基因的W2038位点利用CSE策略成功实现了G到T，A到G，甚至TG到AT的碱基替换，创制了新的抗除草剂突变。值得指出的是，CSE方案能够很好地配合Cas9-NGG和Cas9-NG实现碱基替换，因此CSE方案有望兼容其他识别不同PAM的Cas9变体，从而在基因组任意位点上进行碱基替换。此外，动物和植物细胞对Cas9切割的NHEJ修复结果类似，因此作者相信CSE方案也能够在动物细胞中实现碱基替换。

该研究结果有以下几方面的重要意义：

很大程度上改变了“仅仅依靠Cas9的DNA切割功能及细胞自发的NHEJ途径无法进行碱基替换”的观点。

在碱基替换型产品的推广应用方面，尤其是在以所用方法进行监管的国家和地区，CSE方法具有明显优势。例如，澳大利亚最新的监管政策中规定，只利用Cas9进行编辑得到的植物及动物产品为非转基因产品，而利用碱基编辑工具（如CBE，ABE和PE等）得到的产品按照转基因监管。

目前的碱基编辑工具（CBE，ABE，PE等）的底层专利，多为国外垄断;CSE方案是完全不同的碱基替换策略，或可突破这些底层碱基编辑专利的限制。

中国农业大学植物保护学院姜临建副教授和青岛清原化合物有限公司李华荣博士为文章的共同通讯作者，植保学院在读博士研究生阳威，清原公司戚伟、李玉才为该文的共同第一作者。研究得到了国家科技重大专项和国家自然科学基金的资助。