王宏璐，黄文静，黄志伟，原尚奇，解诗雨，吴楠

二维相关中红外光谱判别牛奶中的四环素

王宏璐，黄文静，黄志伟，原尚奇，解诗雨，吴楠通信作者

（天津农学院 工程技术学院，天津 300384）

基于二维相关中红外光谱法，建立一种快速判别牛奶中四环素的分析方法。分别配置20个纯牛奶和20个掺杂四环素牛奶样品（浓度区间为0.005～30 mg/L）。室温下，在400～4 000 cm-1范围内采集牛奶样品的常规一维谱数据。以牛奶中掺杂四环素浓度为外扰，分别在1 500～1 700 cm-1和3 250～3 450 cm-1波段区间内构建同步和异步二维相关谱，研究其相关谱特性。通过对同步谱中交叉峰的正负以及异步谱中相同位置是否存在交叉峰，推断1 550 cm-1和1 640 cm-1处所对应的基团吸收峰来自于牛奶中的四环素，是由C＝＝N键和C＝＝O键的伸缩振动引起的。同时，在3 310 cm-1处的波峰也来自于四环素，是由N－－H拉伸及弯曲振动引起的。结果表明，对二维相关中红外光谱特性的研究，可以定性判别牛奶中是否掺杂四环素。

牛奶；四环素；中红外光谱；二维相关

近些年，人们对牛奶的需求日益增加，牛奶的质量是消费者挑选牛奶的首要因素。牛奶中掺杂的有害物质会影响人类健康，降低牛奶品质，所以，建立牛奶掺杂物质准确、快速的检测方法是必需的。红外光谱分析法因具有方便快捷和在线检测等优点已经广泛运用在各种掺杂物质的判别上[1]。例如，中红外光谱法（Mid infrared，MIR）可以在不破坏样品的情况下对牛奶中的微量物质进行有效提取分析[2]。但由于待检测物成分复杂，外界条件等因素的影响，常规的一维光谱技术对掺杂物的解析及定性定量分析都存在一定的困 难[3]。二维相关光谱技术因具有更高的分辨率和图谱解析能力，可以区分一些不明显的、被覆盖的波峰，通过交叉峰的正负对比和基团吸收峰强度变化来判断某纯物质中是否掺杂其他物质。例如，当浓度等因素影响样品体系时，样品的各种化学成分会“选择性”的变化，从而得到特定的二维相关谱图[4]。由于二维相关光谱法的良好解析能力，现已被广泛应用于牛奶及其他物质中各种掺杂物的判别分析[5-10]。随着市场需求的不断增长，养殖户使用的兽药数量持续攀升，四环素是四环素类抗生素中最基本的化合物，也是牛奶中常见的抗生素之一[11-12]。四环素具有很好的抗菌作用，主要用于治疗衣原体感染的疾病，其毒性不大，但副作用多见，如恶心、呕吐，食欲减退，二重感染，影响骨骼和牙齿生长等[12]。本文研究牛奶中四环素的二维相关中红外（MIR－MIR）光谱特性，探讨利用二维相关光谱鉴别纯牛奶和掺杂四环素牛奶的可行性。

1 材料与方法

1.1 样品处理

本试验采用在超市购买的某品牌同一批次的纯牛奶。四环素标品粉末购自Solarbio（纯度＞99%）。四环素母液由超纯水制备（100 mg/L），并在4 ℃下储存。用超纯水稀释母液制备不同浓度的工作标准溶液。在10 mL牛奶样品中加入10 μL的工作标准溶液，所造成的牛奶样品的体积变化忽略不计。共配制10个不同浓度梯度的四环素掺杂牛奶，浓度分别为0.005、0.02、0.06、0.1、0.4、0.8、2、6、10和30 mg/L。每个浓度梯度设2个重复，共获得20份四环素掺杂牛奶样品。同时，准备了20份纯牛奶样品。用中红外仪采集了40个样品的光谱数据。

1.2 光谱采集

采用美国PerkinElmer公司的傅里叶变换中红外光谱仪，在室温下对牛奶样品进行光谱采集。样品池为仪器自配的衰减全反射附件。中红外光谱的扫描范围为400～4 000 cm-1，分辨率为 4 cm-1，扫描间隔为8 cm-1，扫描次数为 8次，每个浓度样品测量2次。

1.3 分析方法

利用unscrambler分析程序，对输入的掺杂牛奶光谱数据进行多元散射校正，采用Savitzky－ Golary方法对原始光谱数据进行平滑预处理，减少对判别模型的干扰。利用2D－shige软件构建二维相关谱。以平均谱作为参考，得到二维红外相关图。在同步谱等高线图中，若有来源相同的两个物质，则在谱图中交叉峰体现为正相关，若两物质来源不相同，交叉峰显示为负相关。

2 结果与分析

2.1 纯牛奶和掺杂四环素牛奶的中红外光谱图

图1是20个纯牛奶和20个掺杂不同浓度四环素牛奶样品在全波段的中红外光谱图。由图1可以发现，纯牛奶和掺杂四环素牛奶样品的中红外光谱图有较好的重合度，峰值都大致出现在 1 068、1 540、1 640、1 740、2 916 cm-1和3 450 cm-1左右。这表明简单地通过一维谱形状和谱峰位置很难判别牛奶中是否掺杂四环素。

图1 纯牛奶（a）和掺杂四环素牛奶（b）样品的中红外光谱图

2.2 二维相关谱1 500～1 700 cm-1波段区间

以牛奶中掺杂的四环素浓度为外扰，随着浓度的增大，在1 500～1 700 cm-1波段内有明显的光谱信息变化，因此选取这一波段来研究掺杂四环素牛奶的二维相关光谱特性。在此区间构建同步二维相关中红外谱和其对应的自相关谱（图2）。同时构建掺杂四环素牛奶的异步二维相关谱（图3）。同步二维相关谱是关于对角线对称的，在对角线上出现的交叉峰为自相关峰且总是正的，表明牛奶中四环素浓度变化引起的光谱强度变化的程度。之前文献报道过在1 200～1 700 cm-1，掺杂牛奶与纯牛奶间可能存在细微差别，其中包含有掺杂物的光谱信息；而在900～1 200 cm-1，其光谱信息主要由纯牛奶的固有组分所引起[7]。图2显示，在1 550 cm-1处出现自相关峰，这主要是由四环素中C＝＝N键的伸缩振动引起的[4]。而在1 640 cm-1处出现的自相关峰是由于四环素中的C＝＝O伸缩振动引起的[13]。

在图2a中，可以观察到在对角线外有3个较强的交叉峰出现，分别在（1 550，1 640），（1 640，1 590）和（1 550，1 590）cm-1处。进一步判断交叉峰的正负可知，在（1 550，1 640）cm-1处交叉峰为正值，表明1 550和1 640 cm-1处的2个波峰所对应的官能团都来自于同一物质。而在异步谱 1 550和1 640 cm-1处并未出现交叉峰（图3），进一步说明1 550和1 640 cm-1处的波峰来自于同一物质，即牛奶中的四环素。此外，图2a显示，在（1 640，1 590）和（1 550，1 590）cm-1处的交叉峰为正值，异步谱（图3）进一步显示，在（1 640，1 590）和（1 550，1 590）cm-1处均出现了交叉峰，表明所对应的物质的变化速率不同。说明1 640和1 590 cm-1处，以及1 590和1 550 cm-1处的波峰分别来自于不同的物质。综上，1 550和1 640 cm-1处所对应的基团吸收峰来自牛奶中的四环素，而 1 590 cm-1处所对应的吸收峰可能来自纯牛奶中的物质。

图2 1 500～1 700 cm-1波段下掺杂四环素牛奶的二维相关中红外（a）同步谱与（b）自相关谱

图3 1 500～1 700 cm-1波段下掺杂四环素牛奶的异步二维相关中红外谱

2.3 二维相关谱3 250～3 450 cm-1波段区间

以牛奶中掺杂的四环素浓度为外扰，在3 250～3 450 cm-1区间构建同步二维相关中红外同步谱和其对应的自相关谱（图4）。从图4可以看出，在3 310 cm-1处出现自相关峰，这个自相关峰主要来自于四环素中N－－H拉伸振动及其弯曲振动[13]。Qin等[14]在利用中红外光谱研究四环素类抗生素粉末样品过程中，也发现四环素、土霉素、多西环素、金霉素等均在3 310 cm-1附近有特征峰，这可能是由于四环素类物质具有相同的分子结构。根据上述对掺杂四环素牛奶的二维相关中红外光谱特性的研究，可以定性判定牛奶中是否掺杂四 环素。

图4 3 250～3 450 cm-1波段下掺杂四环素牛奶的二维相关中红外同步谱与（a）自相关谱（b）

3 结论

本研究利用二维相关中红外光谱法对纯牛奶中掺杂的四环素（所掺四环素浓度为0.005～ 30 mg/L）进行判别分析。研究发现，在1 500～ 1 700 cm-1波段中，1 550和1 640 cm-1处所对应的基团吸收峰来自于牛奶中的四环素中C＝＝N键和C＝＝O键的伸缩振动。在3 250～3 450 cm-1波段，3 310 cm-1处的自相关峰来自于N－－H拉伸振动及其弯曲振动。这一结果表明，二维相关光谱法弥补了一维谱技术的不足，能将更弱的变化信息体现出来。对二维相关光谱图的分析，可以有效区分纯牛奶和掺杂四环素牛奶。未来，也可将二维相关光谱法的结果与化学计量法结合，进一步对牛奶中的四环素进行定量分析。

[1] 吴楠，海霞，杨仁杰，等. 色谱和光谱技术在牛奶抗生素检测中的应用[J]. 黑龙江畜牧兽医，2018（17）：194-197.

[2] 杨仁杰，连增艳，董桂梅，等. 二维相关谱在环境科学中的应用与展望[J]. 光谱学与光谱分析，2019（6）：18-22.

[3] 徐琛善，吴楠，海霞，等. 中红外光谱快速检测牛奶中土霉素的可行性研究[J]. 天津农学院学报，2018，25（3）：70-73.

[4] Yang R J，Liu R，Xu K X. Determination of melamine of milk based on two-dimensional correlation infrared spectroscopy[J]. Proceedings of SPIE——The International Society for Optical Engineering，2012，8229（1）：29.

[5] 杨仁杰，刘蓉，徐可欣. 二维相关光谱结合偏最小二乘法测定牛奶中的掺杂尿素[J]. 农业工程学报，2012，28（6）：259-263.

[6] Yang R J，Liu R，Dong G M，et al. Two-dimensional hetero-spectral mid-infrared and near-infrared correlation spectroscopy for discrimination adulterated milk[J]. Spectrochimica Acta Part A，2016，157：50-54.

[7] 崔彩路，杨仁杰，朱文碧，等. 二维相关红外谱结合PARAFAC-MLR判别掺杂牛奶[J]. 天津农学院学报，2015，22（1）：23-27.

[8] 杨仁杰，刘蓉，徐可欣. 基于近红外光谱对牛奶中掺杂尿素的判别分析[J]. 食品科学，2012，33（16）：120-123.

[9] 焦东升，孙雪彬，朱文碧，等. 基于二维红外相关谱判别掺假蜂蜜[J]. 天津农学院学报，2017，24（2）：67-71.

[10] 林浩坚，刘刚，杨卫梅，等. 二维相关红外光谱分析鉴别不同产地黑木耳[J]. 中国农业科技导报，2019（1）：160-169.

[11] Sivakesava S，Irudayaraj J. Rapid determination of tetracycline in milk by FT-MIR and FT-NIR spectroscopy[J]. Journal of Dairy Science，2002，85（3）：487-493.

[12] 邸静. 牛奶中四环素类兽药残留的快速检测关键技术应用研究[J].食品安全导刊，2019（17）：36-37.

[13] Gunasekaran S，Varadhan S R，Karunanidhi N. Qualitative analysis on the infrared bands of tetracycline and ampicillin[J]. Proc Indian natn Sci Acad，1996，62（4）：309-316

[14] Qin J，Xie L，Ying Y. Rapid determination of tetracyclines hydrochloride using ATR FT-MIR spectroscopy[J]. Food Analytical Methods，2016，9（10）：2880-2886.

Identification of tetracycline in milk by two-dimensional correlation mid infrared spectroscopy

WANG Hong-lu, HUANG Wen-jing, HUANG Zhi-wei, YUAN Shang-qi, XIE Shi-yu, WU NanCorresponding Author

（College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Based on the two-dimensional correlation mid infrared spectroscopy, a rapid method for the identification of tetracycline in milk was established. 20 pure milk samples and 20 tetracycline adulterated milk samples（0.005～30 mg/L）were prepared respectively. At room temperature, the conventional one-dimensional spectral data of milk samples were collected in the range of 400～4 000 cm-1. Taking the concentration of tetracycline in milk as the external perturbation, synchronous and asynchronous two-dimensional correlation spectra were constructed in the range of 1 500～1 700 cm-1and 3 250～3 450 cm-1, respectively. The absorption peaks at 1 550 cm-1and 1 640 cm-1were supposed to come from the tetracycline in milk, which were caused by the stretching vibration of C＝＝N and C＝＝O bonds. At 3 310 cm-1, the peak also came from tetracycline, which was caused by the stretching and bending vibration of N－－H bond. The results showed that the analysis of two-dimensional correlation mid infrared spectral characteristics can qualitatively determine whether the milk is adulterated with tetracycline.

milk; tetracycline; mid infrared spectroscopy; two-dimensional correlation

1008-5394（2020）03-0079-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.03.018

O657.33

A

2019-12-10

大学生创新创业训练计划项目（201910061090）；国家自然科学基金项目（21607114，41771357）

王宏璐（2000-），女，本科在读，主要从事环境与新能源方面的研究。E-mail：809048865@qq.com。

吴楠（1984-），女，副教授，博士，主要从事环境污染物方面的研究。E-mail：nwu@tjau.edu.cn。

责任编辑：杨霞