王宁 顾利芬

【摘 要】目的：采用反相高效液相色谱法测定丁苯酞粗品中同分异构体异丁基苯酞的含量。方法：采用RP-HPLC方法进行测定，采用CAPCELL PAK ADME键合金刚烷基色谱柱，流动相为乙腈-水（40：60），流速1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温30℃，外标法。结果：异丁基苯酞在0.505μg/ml～2.527μg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好（r=0.9998），回收率为102.0%（n=9），RSD为4.7%。结论：经方法学验证，本方法准确，简便可靠，重复性好，为进一步提高丁苯酞制剂在临床上使用的安全性提供参考。可作为丁苯酞原药的质量控制方法之一。

【关键词】丁苯酞粗品;异丁基苯酞;同分异构体;反相高效液相色谱法

【中图分类号】R965   【文献标识码】A    【文章编号】1672-3783（2020）10-0100-02

Determination of isomer isobutylphthalide in crude butylphthalide by RP-HPLC

WANG Ning  Gulifen

（Suzhou Erye Pharmaceutical Co.， Ltd. Suzhou 215131）

【Abstract】Objective：The content of isomer isobutylphthalide in crude butylphthalide was determined by RP-HPLC. Methods：RP-HPLC method was used for the determination，a CAPCELL PAK ADME bonded adamantance column was used，the mobile phase consisted of acetonitrile-water（40：60），the flow rate of 1.0ml·min-1，the detection wave length was at 280nm and the column remained at 30℃. Results：The standard curve was in good linearity in the range of 0.505μg/ml～2.527μg/ml，r=0.9998.The average recovery rate was 102.0%（n=9），RSD=4.7%.Conclusion：The method is accurate，simple and reliable，good repeatability.To provide reference for improving the clinical safety of butylphthalide preparation.It can be used as one of the quality control methods for butylphthalide.

【Key words】Butylphthalide crude product;Isobutylphthalide;Isomer ;RP-HPLC

正丁基苯酞（n-butylphthalide，NBP）簡称丁苯酞，俗称芹菜甲素，是芹菜挥发油的主要成分。丁苯酞具有很强的抗惊厥、抗气喘、增加血流量等多种药理活性，是我国第三个自主研发的一类新药，全球第一个以“缺血性脑卒中治疗”为主要适应症的全新化学药物。异丁基苯酞是合成过程中潜在的副产物，是丁苯酞的同分异构体，它们极性相近，通常难以完全分离。为保证制剂在临床上的用药安全，需要对丁苯酞原药中异丁基苯酞的含量加以控制。

1 仪器与试剂

1.1 仪器美国Waters2695高效液相色谱仪（Waters e2695分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统、柱温箱和自动进样器;二极管阵列扫描检测器（Waters2489 PDA检测器）;色谱工作站（Empower3）），美国Agilent 1260高效液相色谱仪（包括四元泵、自动进样器、柱温箱、在线脱气机、紫外检测器;色谱工作站OpenLab CDS2.4），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司XS3DU（百万分之一）和XS105DU（十万分之一）电子分析天平。

1.2 试药对照品异丁基苯酞（苏州二叶制药有限公司自标批号S190017），含量为99.27%;对照品丁苯酞（苏州二叶制药有限公司自标批号S190001），含量为99.24%;样品丁苯酞粗品（苏州二叶制药有限公司，批号XS190419-1-6、0190701、0190801、0190802）;甲醇和乙腈均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 系统适用性溶液的制备：称取丁苯酞对照品和异丁基苯酞对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成含异丁基苯酞0.01mg/ml，和丁苯酞1mg/ml的溶液。

2.2 对照品溶液的制备：称取异丁基苯酞对照品适量，用甲醇制成含异丁基苯酞1μg/ml的溶液。

2.3 供试品溶液的制备：取本品适量，精密称定，用甲醇溶解并制成每1ml约含1mg的溶液。

2.4 色谱条件色谱柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK ADME，4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱;流动相：乙腈-水（40：60）;流速1.0ml/min;检测波长：280nm;柱温：30℃;自动进样，进样体积：20μl。空白溶液见图1;系统适用性溶液见图2。

2.5 专属性试验 取同一批样品适量（批号XS190419-1-6），在各破坏条件下进行破坏，再按“2.4”项下的色谱条件分别进样20μl进行测定，计算结果，结果见表1。

结果表明，丁苯酞粗品在碱破坏下较不稳定，在各破坏条件下均未检出异丁基苯酞，不干扰异丁基苯酞的检测。

2.6 线性关系考察 称取异丁基苯酞对照品适量，用甲醇稀释制成约0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml的溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得线性回归：Y=11.066X-0.2588，r=0.9998，Y轴截距与100%响应值的比值为2.4%。结果表明异丁基苯酞在0.505μg/ml～2.527μg/ml浓度范围内线性关系良好。

2.7 定量限和检测限 精密吸取“2.2”项下对照品溶液适量，用甲醇逐级稀释，进行测定;以信噪比（S/N） 10：1时确定定量限浓度为0.227μg/ml，相当于供试品浓度的0.02%，以信噪比（S/N）3：1时确定检测限浓度为0.034μg/ml，相当于供试品浓度的0.003%。

2.8 重复性试验 取同一批样品（批号XS190419-1-6），用甲醇稀释制成每1ml约含丁苯酞1mg和异丁基苯酞1μg的溶液，平行制备6份加标混合溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，结果样品中异丁基苯酞的平均含量为0.09%，RSD为5.5%（n=6），最大绝对差值为0.01%，表明本方法重复性良好。

2.9 中间精密度试验 换人换仪器换日期取同一批样品（批號XS190419-1-6），用甲醇稀释制成每1ml约含丁苯酞1mg和异丁基苯酞1μg的溶液，平行制备6份加标混合溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，结果样品中异丁基苯酞的日间平均含量为0.09%，日间RSD为4.9%（n=12），日间最大绝对差值为0.01%，表明本方法中间精密度良好。

2.10 稳定性试验 取同一批样品（批号XS190419-1-6），用甲醇稀释制成每1ml约含丁苯酞1mg和异丁基苯酞1μg的溶液1份，分别在0、2、4、6、8、10、24小时按“2.4”项下色谱条件进行测定，结果样品中异丁基苯酞峰面积的RSD为0.84%，表明供试品溶液24小时内稳定性良好。

2.11 加样回收率试验 取同一批样品（批号XS190419-1-6）约20mg，置20ml量瓶，共9份，3份为一组，分别按照异丁基苯酞限度含有量的50%、100%、200%加入异丁基苯酞对照品母液，用甲醇溶解并稀释制备成供试溶液，每份溶液按上述色谱条件进行测定并计算回收率，结果平均回收率（n=9）为102.0%，RSD为4.7%。

2.12 样品测定 取3批丁苯酞粗品，分别按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，再按“2.4”项下的色谱条件分别进样20μl进行测定，计算结果，结果见表3。

2.13 结论

通过方法学验证，结果表明该方法精密度、准确度高，线性关系良好，能满足丁苯酞粗品中异丁基苯酞含量测定的要求。

3 讨论

3.1 异丁基苯酞的控制策略

异丁基苯酞，是制备丁苯酞过程中可能产生的副产物。它是由于起始物料正丁基氯化镁可能含有少量的异丁基基氯化镁，与邻羧基苯甲醛反应就会生成异丁基苯酞，反应式如下：

本公司拟定的质量控制策略是控制在丁苯酞粗品中杂质异丁基苯酞不得过0.1%，并且对多批次样品进行测定，符合要求。杂质异丁基苯酞属于工艺杂质，从粗品到成品的制备过程中不会在产生，因此，只要控制了粗品中的异丁基苯酞含量，就可以控制住丁苯酞成品中异丁基苯酞的含量。

3.2 分离度试验

我们尝试了CAPCELL PAK PFP五氟苯基色谱柱未能分离丁苯酞和异丁基苯酞，使用CAPCELL PAK C18 MG和CAPCELL PAK ADME色谱柱均能够得到丁苯酞和异丁基苯酞良好的分离结果，对比之下，ADME色谱柱可在相对较短时间内实现更好地分离结果。我们也尝试柱温由40℃降低到30℃，两化合物的保留时间延长了约4分钟，但分离度由1.6提高至1.7;同时在30℃条件下，尝试了在流动相中添加了100mM磷酸二氢铵，发现分离度为1.6，并无明显改善，添加缓冲盐对分离度无明显影响。最终得出“2.4”项下的色谱条件是最佳的检测方法。

3.3 结论：本法操作简便、结果准确、灵敏度高、重现性好，可作为丁苯酞质量控制的方法。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：374- 378.

[2] 国家药品监督管理局药品审评中心.化学药物杂质研究的技术指导原则[S].2005.

[3] 国家药品监督管理局药品审评中心.化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则[S].2005.