钟敏华 吴展陵 李新军 涂平华 杨英

1武汉科技大学附属孝感医院呼吸科432100;2武汉科技大学430081

肺癌是常见的呼吸科恶性肿瘤，以非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer，NSCLC)所占比例最高，大部分患者由于病灶局部发展或转移而导致病情无法痊愈甚至病死[1]。目前，手术是NSCLC患者最有效的治疗手段，必要时联合放化疗。近年来发现，miRNA 在慢性淋巴细胞白血病、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤组织中表达异常[2]。另有文献表明，miRNA 在细胞增殖分化、凋亡和浸润等病理过程中发挥重要的作用[3]。廖立等[4]研究表明，miR-221、miR-98在肺癌组织中表达量较正常组织明显增高;而miR-222、miR-155则明显降低。抑素广泛分布于多种生物组织和细胞中，经证实，其在鼻咽癌、宫颈癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌症组织中表达异常，且与淋巴结转移、肿瘤大小、病理分期等因素存在明显关系[5]。有研究表明，肺鳞癌组织抑素表达量明显增加，且分化程度越低则表达量越高[6]。因此，抑素在NSCLC的发生、发展中可能发挥重要的作用，但关于其具体机制尚不清楚，故本文探讨抑素在NSCLC的发生、发展中的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2019年1月至2020年1月期间武汉科技大学附属孝感医院收治的6例NSCLC 手术患者作为研究对象，并在切除术中采集标本。标本采集前通过武汉科技大学附属孝感医院医学伦理委员会批准 (SW2017005)，并由患者签署知情同意书。严格要求所有术中采集标本未实施放化疗，且在术后0.5 h内置于液氮中保存。

1.2 方法 转染Luc-anti-miR-539的细胞可抑制miR-539，作为低表达组。转染Luc-anti-抑素可抑制抑素的表达，作为抑制抑素组。以未转染的细胞作为阴性对照组，以转染miR-539 的细胞为过表达组，比较2组miR-539、抑素的表达，验证是否转染成功。采用Hoechst核染色及EDU 标记荧光免疫染色，通过RT-PCR 检测抑制抑素组、过表达组、低表达组的miR-539 表达水平。CCK-8 检测细胞增殖，划痕试验检测细胞迁移，流式细胞术检测细胞凋亡。

1.2.1 提取总RNA 从液氮中取组织，采用Tizol试剂提取总RNA。应用紫外分光光度计检测所提取RNA的浓度和纯度，当A260/A280=1.8～2.1，则提示合格。使用1%琼脂糖凝胶电泳法鉴定RNA 的完整性，当亮度28S/18S比值＞2，则提示完整性良好。

1.2.2 miR-539定量测定 使用反转录荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)技术，以U6 为内参照物，U6 反 转 录 引 物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATATGGAAc TGC-3′，正 向 引 物：5′-GGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，反向引物：5′-CAGTGAGGGTCCGAGGT-3′;利用反转录引物，把总RNA 反转录为cDNA，其反应体系为：10×反转录缓冲液1.5μl，100 nmol/L d NTPs 0.15μl，反转录酶1.0μl，RNase抑制剂0.19μl，总RNA 5.0μl，加DEPC水至15μl，轻轻混匀后，16℃，30 min;42℃，60 min;85℃，5 min;转换反应体系为：2×PCR 缓冲液10μl，20×miRNA-539特定引物和荧光探针1μl，反转录产物1μl，加DEPC水至20μl，置ABI 7500荧光PCR 仪上按照95 ℃5 min，95 ℃15 s，60 ℃45 s反应40个循环，4 ℃，保存采集数据分析结果。

1.2.3 miR-539在NSCLC 中靶基因的筛选 利用生物信息学方法结合eDNA 微阵列检测结果，在Pic Tar、TargetScan和miRBase Targets 3个数据库中筛选miR-539的靶基因，且经eDNA 微阵列检测结果显示在NSCLC (肺鳞癌和肺腺癌)中抑素基因表达上调。抑素基因m RNA 的3′UTR含有miR-539 的种子序列互补结合位点。利用PCR 扩增含有此结合位点的片段，并克隆插入pcDNA3/EGFP 质粒中EGFP 编码区下游的Bam HIEcoRI位点。构建完成的质粒pcDNA3/EGFP-PHB 3′UTR 经Bam HI-EcoRI 酶 切 产 生234 bp的片段，表明质粒构建成功。将抑素基因m RNA 的3′UTR 中miR-539种子序列结合位点内的3个碱基进行定点突变后，克隆插入pcDNA3/EGFP质粒中EGFP 编码区下游的Bam HI-EcoRI位点。构建完成的质粒pcDNA3/EGFP-PHB 3′UTRmut经Bam HI-EcoRI酶切产生234 bp 的片段，表明质粒构建成功。将pcDNA3/EGFP-PHB 3′UTR 质粒与Luc-anti-miR-539共转染Hoechst、EDU、Merge 细胞，利用生物信息学预测结合NSCLC与正常组织基因表达谱差异的基因芯片分析，确定了抑素是miR-539的候选靶基因。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件，2组符合正态分布的计量资料采用t 检验;3组比较采用单因素方差分析，进一步组组间比较采用SNK-q检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-539 过表达对NSCLC 细胞增殖、迁移指标的影响 在转染24 h 后采用RT-PCR 测定miR-539表达量，过表达组抑素的m RNA 相对表达量为(1.00±0.07)，阴性对照组抑素的m RNA相对表达量为 (0.20±0.02)，二者差异有统计学意义(t=26.917，P ＜0.001)。过表达组细胞增殖能力 (4.21±1.21)较阴性对照组 (8.09±0.97)降低(t=6.128，P ＜0.001)，见图1。过表达组细胞迁移能力[(514.28±36.14)个]较阴性对照组[(1 500.33±156.25)个]降低 (t=15.060，P ＜0.001)，见图2。

图1 CCK-8检测过表达组和阴性对照组的细胞增殖曲线

图2 过表达组和阴性对照组的细胞迁移能力比较

2.2 miR-539 过表达对NSCLC 细胞凋亡的影响 过表达组的细胞凋亡率 [(53.21±7.59)%]较阴性对照组 [(40.25±6.21)%]增高 (t=3.237，P =0.009)，见图3。

2.3 抑素、miR-539 对NSCLC 细胞增殖指标的影响 抑制抑素组 (11.32±0.36)和低表达组(9.03±0.28)的细胞增殖能力较过表达组(5.69±0.08)高(F =672.994，P ＜0.001)，进一步组间比较的结果如下：抑制抑素组与低表达组细胞增殖能力比较，差异有统计学意义 (q=30.603，P ＜0.01)，抑制抑素组与过表达组细胞增殖能力比较，差异有统计学意义 (q =51.586，P ＜0.01)，低表达组与过表达组细胞增殖能力比较，差异有统计学意义 (q=20.983，P ＜0.05)，见图4。

2.4 抑素、miR-539 对NSCLC 细胞凋亡指标的影响 抑制抑素组[(38.56±5.24)%]的细胞凋亡率较低表达组[(47.26±4.98)%]和过表达组[(58.61±6.32)%]低 (F =19.735，P ＜0.001)，进一步组间比较的结果如下：抑制抑素组与低表达组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(q=3.844，P ＜0.05)，抑制抑素组与过表达组细胞凋亡率能力比较，差异有统计学意义 (q =8.859，P ＜0.05)，低表达组与过表达组细胞凋亡率比较，差异有统计学意义 (q =5.015，P ＜0.05)，见图5。

图3 过表达组和阴性对照组的细胞凋亡率 ×100

图4 抑素、miR-539对NSCLC细胞增殖的影响

3 讨论

miRNAs在癌症组织中的表达及其作用逐渐被关注。miRNAs属于非编码的小分子单链RNA，长度约为19～25个核氨酸，通过靶点基因结合调控基因转录后表达。同时，相关文献显示，miRNAs在癌症细胞增殖、迁移和凋亡等生物过程发挥重要的作用[7]。另有文献显示，miRNAs对基因转录及肿瘤相关信号通路具有重要的调控作用，并可作为癌症的药物靶点[8]。因此，miRNAs在癌症发生、发展中发挥重要的角色。miRNAs主要包括抑癌基因和促癌基因，对肿瘤靶向治疗药物的研制有一定意义。相关文献显示，miR-539表达失调与NSCLC细胞增殖及细胞凋亡之间具有紧密的关系[9]。因此，探寻miR-539在NSCLC发生、发展中的作用机制可使患者在提高NSCLC 治疗效果和生活质量中受益。相关文献显示，miR-539 在NSCLC组织中表达下调与生存时间缩短具有紧密的关系，且表达下调的miR-539 通过促进细胞增殖而参与NSCLC发生、发展[10]。但关于miR-539通过抑素调控NSCLC的细胞增殖、迁移和凋亡机制研究较为罕见。

本研究结果显示，miR-539在A549细胞中表达明显低于正常细胞，与相关研究结论相一致[11]。miRNA 是非编码的短小RNA，其在调节机体新陈代谢、生长发育、免疫应答等过程中发挥重要的作用，而miR-539可能作为抑癌基因而在NSCLC发生、发展中发挥重要的意义。进一步研究表明，NSCLC细胞转染miR-539后，miR-539表达明显增高，细胞增殖和迁移能力明显降低，细胞凋亡明显增高。顾立学等[12]研究表明，miR-539 在甲状腺瘤组织中的表达明显下调，可通过靶向拮抗膜相关鸟苷酸激酶蛋白1的表达，进而抑制癌症细胞增殖和迁移。同时，张琼等[13]研究表明，骨肉瘤MG-63细胞中，miR-539表达下调≥50 倍。因而miR-539通过靶向作用于鸟苷酸激酶蛋白的抑癌基因。结合本研究结果，miR-539可作为NSCLC 的抑癌基因而明显抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。本研究进一步利用生物信息学预测结合NSCLC 组织与正常组织基因表达谱差异的基因芯片分析，明确抑素为miR-539 的候选靶基因，采用荧光报告载体实验进一步确证抑素受到miR-539的直接调控。过表达miR-539 的细胞增殖率、细胞迁移率明显降低，细胞凋亡率明显增高，而靶向抑制抑素、低表达miR-539的细胞增殖率、细胞迁移率相对增高，细胞凋亡率相对降低，可见靶向抑制抑素及低表达miR-539可促进细胞增殖迁移，而抑制细胞凋亡;反之，过表达miR-539 可抑制细胞增殖迁移，促进细胞凋亡。笔者认为：miR-539是通过抑素调控NSCLC的细胞增殖、转移和凋亡。邓学军等[14]对凋亡相关基因的研究表明，转染miR-539后抑癌基因和促凋亡基因表达明显上调，而抗凋亡基因表达明显下调，间接反映miR-539 可明显增强癌症细胞株对化疗药物诱导凋亡的敏感性。因此，miR-539在NSCLC的细胞增殖迁移和凋亡中起到重要作用，并提示抑素参与其调控过程，为miR-539在肺癌发生、发展过程中的功能及作用机制提供理论和实验基础。抑素属于抑癌基因，分布于线粒体内膜和细胞核内，对细胞生长分化和凋亡等生物过程发挥负转录调控作用。miR-539、抑素在NSCLC组织中低表达，且细胞分化程度越低，其表达越高[15]。抑素是miR-539 的直接靶基因，miR-539通过上调抑素进而对NSCLC 细胞增殖、迁移和凋亡具有重要的调控作用。

图5 抑制抑素组、低表达组和过表达组的细胞凋亡比较 ×100

综上所述，miR-539、抑素属于抑癌基因，miR-539 过表达可明显抑制细胞增殖迁移，miR-539低表达或靶向抑制抑素可明显促进细胞增殖迁移;miR-539 过表达可明显促进细胞凋亡，miR-539低表达或靶向抑制抑素可明显抑制细胞凋亡，miR-539可能通过抑素调控NSCLC 细胞增殖迁移和凋亡过程。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突