HPLC法测定芪归益母膏中芍药苷的含量
2020-10-10冉丽娟曾珍黎昌权
冉丽娟，曾珍，黎昌权
（重庆市万州食品药品检验所，重庆 万州 404000）
芪归益母膏是重庆市万州区中医院在多年临床治疗、应用过程中总结研发的自制制剂，处方由黄芪、当归、益母草、白芍等四味中药组成，具有益气养血、调经止痛的作用，临床上用于月经不调及痛经等，临床应用效果满意。该制剂现行质量标准只有通则检查和薄层色谱鉴别试验，白芍在该制剂中为臣药，其指标成分明确，《中国药典》2015年版一部［1］将芍药苷作为白芍定量分析的指标之一。本文采用高效液相色谱法对芪归益母膏中白芍所含活性成分芍药苷的含量进行了方法学研究，为该制剂的质量控制提供了定量检测方法。
1 仪器与试药
岛津LC-20A高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，LCsolution色谱工作站。Sartorius型号为CP224S电子天平 （Max 210 g；d＝0.1 mg）、Sartorius型号为ME215S电子天平 （Max 210 g；d＝0.01 mg），分液漏斗，0.45μm微孔滤膜。
芍药苷对照品 （购买自中国食品药品检定研究院，批号：110736-201842，含量以97.4%计，使用前无需处理，供含量测定用），芪归益母膏 （重庆市万州区中医院提供，批号：20190605、20190829、20191029），正丁醇、乙醇、磷酸等均为分析纯，乙腈为色谱纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件［2-3］
色谱柱：InertSustainC18柱5μ（250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸 （15∶85）；流速：1.0 mL／min；检测波长：230nm；进样量：20μL。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取芍药苷对照品14.19mg，置50mL量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理15min使溶解，放冷，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液3.00mL，置10mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3 供试品溶液制备
取本品适量，混匀，精密称取1.0g，置分液漏斗中，加水30mL溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次30mL，合并正丁醇提取液，然后余液再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30mL。最后所得正丁醇液置蒸发皿中，在水浴上蒸干，残渣加稀乙醇10mL溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。
2.4 阴性供试品溶液的制备
按处方 （不含白芍）及本品工艺制备供试品，按 “2.3”项方法处理即得阴性供试品溶液。
2.5 系统适用性试验
分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，色谱条件同上。记录色谱图，结果见图1。图1可得出，在此条件下，阴性供试品对芍药苷的测定无干扰，而且芍药苷和其他成分可达到基线分离，分离度R＞1.5。
图1 芪归益母膏HPLC图谱
2.6 线性关系考察
分别精密量取 “2.2”项下的对照品贮备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置10mL量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下，进样量为20μL进行测定，记录色谱图，以峰面积A与芍药苷对照品的浓度C（mg／mL）进行线性回归，得到回归方程为：A＝1.373×104C+2.037，r＝0.999 9。表明芍药苷在0.0276～0.1382mg·mL-1的范围内线性关系良好。
2.7 精密度试验
精密吸取对照品溶液20μL，重复进样6次，记录峰面积，最后RSD为0.52%，表明仪器精密度良好。
2.8 稳定性试验
取同一批次制得的供试品溶液20μL，分别于0，2，4，6，8，12，24 h进样1次，记录色谱图得到峰面积，芍药苷峰面积的RSD为0.56%，保留时间基本不变。表明供试品溶液在24 h是稳定的。
2.9 重复性试验
取同一批号供试品，制备6份供试品溶液，分别测定芍药苷的含量，得其质量分数为1.027mg／g，RSD为0.85%。表明本方法重复性良好。
2.10 回收率试验
称取已得含量的供试品9份，每份1.0g，分别精密加 “2.2”项下的对照品贮备液2、3、4mL（各3份），均按 “2.3”项下的方法处理，计算回收率，结果见表1。
表1 回收率试验结果 （n＝9）
2.11 供试品测定
分别取3批次供试品，按 “2.3”项下的方法制备得到3批供试品溶液，精密量取20μL，测定，每批同时测定3次，按外标法计算芍药苷的含量，结果见表2。
表2 供试品含量测定结果 （n＝3）
3 讨论
1）波长的选择，取供试品液用紫外检测器，在200～400nm扫描，结果在230nm波长处，芍药苷的吸光度最大，故选用230 nm作为检测波长。
2）流动相的选择［2-3］，用不同比例的乙腈-0.05mol／L磷酸氢二钾溶液和不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行检测。结果表明，乙腈-0.1%磷酸 （15∶85）为流动相时，芍药苷峰形对称，分离完全，阴性供试品无干扰，且理论板数高，拖尾因子小，故作为该试验流动相。
3）在芪归益母膏现行质量标准中，仅有通则检查和鉴别试验。据了解芪归益母膏在该院却广泛用于临床，疗效明确，为有效地控制药品质量，建议增加芪归益母膏的定量检测。
4）采用HPLC测定芪归益母膏中芍药苷的含量，受主客观因素的干扰较小，且准确、简便、重复性好，可作为芪归益母膏的定量分析方法。
