孟胜喜，霍清萍，王 兵，付剑亮，彭文波，王宇新，梁 芳，汪天湛，张洪艳，余忠海，彭学丰，李学敏，曹健美，李文涛

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)属于一种严重的神经退行性病变，其主要临床表现为记忆衰退和认知障碍[1]。AD是痴呆最常见的原因，以其高发病率、高病死率成为重要的世界公共卫生问题，同时也是一种严重威胁到老年人的健康和生活质量的疾病[2-3]。随着全球人口老龄化的加剧，AD病人日益增多，尤其是在65岁以上的老年人群中，发生率可高达12%。预计到2050年，AD病人将达到11 500万人，这将极大增加社会和个人的经济负担[4-5]。中医药具有多系统、多靶点、多层次作用特点，并且毒副作用小，安全性较好，在AD的防治上有自身的特点及优势。恒清Ⅱ号方是本课题组长期用于治疗AD 的临床经验方。本实验基于尿代谢组学探讨恒清Ⅱ号方治疗AD的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 仪器及实验用品 Agilent1200高效液相色谱仪(美国安捷伦)；micr-OTOF-QⅡ质谱仪(德国布鲁克)； PoroShell 120EC-C18色谱柱(美国安捷伦)；SAESHIN 90+10(韩国Saeshin)；FIS13-990-16超低温冰箱(Thermoscientific)；FA1204L电子天平(上海越平科学仪器有限公司)。甲酸购于CNW公司(中国上海)；甲醇、乙腈、超纯水均购于Merck(Darmstadt，Germany)公司；2-氯苯丙氨酸(DL-o-Chlorophenylalanine)购于GL Biochem (上海) Ltd.公司。

1.2 实验药物 盐酸多奈哌齐(安理申)购自卫材(中国)药业有限公司，国药准字H20050978；批号：1705080，规格：每片5 mg。恒清Ⅱ号方组成：益智仁30 g，黄芪15 g，菟丝子10 g，川芎10 g，熟地黄15 g，桑寄生10 g，煅石决明10 g，杜仲10 g，地龙10 g，天麻10 g，钩藤10 g。由上海市第六人民医院中药房提供。按处方比例称取药材，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮3次，每次40 min，过滤，合并3次滤液，37 ℃水浴加热浓缩，根据临床的实际用药情况，对药液进行浓缩处理，并以中质量浓度匹配临床的实际用药浓度。中质量浓度浓缩至0.535 0 g/mL，恒清Ⅱ号方低剂量为0.267 5 g/mL，中剂量为0.535 0 g/mL，高剂量为1.070 0 g/mL，分别置于4 ℃冰箱贮存备用。

1.3 实验动物及分组 取SPF级雄性APPswe/PS1dE9双转基因小鼠6月龄50只，随机分为模型组(model组)、恒清Ⅱ号方低剂量组(HQ-L组)、恒清Ⅱ号方中剂量组(HQ-M组)、恒清Ⅱ号方高剂量组(HQ-H组)、安理申组(Aricept组)，每组10只。6月龄C57BL/6J小鼠10只作为正常组(normal组)。全部动物购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2018-0006，预饲养2周，分别单笼喂养，光照与黑暗12 h交替1次，温度(22±2)℃，相对湿度(60±5)%，自由摄食和饮水。

1.4 方法

1.4.1 干预方法 HQ-L组、HQ-M组、HQ-H组分别给予低剂量、中剂量、高剂量恒清Ⅱ号方灌胃，Aricept组用安理申溶液灌胃，均为每日2次。恒清Ⅱ号方低、中、高剂量及安理申溶液给药浓度，依据人和动物体表面积折算系数换算[6]，计算结果为14.8 g/kg。normal组、model组给予等体积生理盐水灌胃，每日2次。各组均持续灌胃30 d。

1.4.2 认知功能测试 干预结束后，采用Morris水迷宫进行定位航行实验和空间探索实验，检测各组小鼠的认知能力，记录逃避潜伏期(escape latencies，EL)和120 s内小鼠通过虚拟平台的次数，即跨越平台次数(number of crossing platforms，NCP)，用Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成对实验的数据采集以及处理。

1.4.3 尿液收集与处理 给药30 d后，收集尿液，用移液枪吸取100 μL尿液样本，加入300 μL甲醇和10 μL内标(2.8 mg/mL，二氯苯丙氨酸)。涡旋30 s混匀；于-20 ℃下静置1 h；于4 ℃下12 000 r/min离心15 min；吸取200 μL上清液，转入进样小瓶中待LC-MS检测分析。

1.4.4 LC- MS分析 仪器分析平台：LC-MS(Thermo，Ultimate 3000LC，Q Exactive)；色谱柱：C18色谱柱[Hyper gold C18 (100 mm×2.1 mm，1.9 μm)]；色谱分离条件为：柱温为45 ℃；流速0.35 mL/min；流动相组成A：水+5%乙腈+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；进样量为10 μL，自动进样器温度4 ℃。

1.4.5 质谱检测参数 正模式：加热器温度300 ℃，鞘气流速45 arb，辅助气流速15 arb，尾气流速1 arb，电喷雾电压3.0 kV，毛细管温度350 ℃，S-Lens RF Level 30%。负模式：加热器温度300 ℃，鞘气流速45 arb，辅助气流速15 arb，尾气流速1 arb，电喷雾电压3.2 kV，毛细管温度350 ℃，S-Lens RF Level 60%。

1.5 统计学处理 原始数据首先利用Thermo工作站软件中Xcalibur转化为CDF格式文件，然后在R软件中利用XCMS包进行峰提取、峰比对和峰过滤，补充缺失峰，数据最终标准化为Excel格式的二维数据矩阵，包含保留时间(retention time，RT)、质荷比(MZ)、观察量(样本)和峰强等信息。将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P 13.0(Umetrics AB，Umea，Sweden)软件进行多元统计分析。

2 结 果

2.1 各组小鼠EL、NCP比较 与normal组比较，model组小鼠EL明显增加，NCP明显减少，差异均有统计学意义(P<0.01)；与model组比较，HQ-M组、HQ-H组、Aricept组小鼠EL明显缩短，穿越平台次数明显增加，差异均有统计学意义(P<0.01)；与HQ-L组比较，HQ-M组、HQ-H组、Aricept组小鼠EL明显缩短，NCP明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与HQ-M组比较，HQ-H组小鼠EL明显缩短，NCP明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Aricept组比较，HQ-H组小鼠EL明显缩短，NCP明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。恒清Ⅱ号方低、中、高剂量之间的作用比较：HQ-H组>HQ-M组>HQ-L组，即恒清Ⅱ号方的量效关系呈正相关；高剂量恒清Ⅱ号方与安理申之间的作用比较，HQ-H组>Aricept组，即高剂量恒清Ⅱ号方的作用要优于安理申。详见表1。

表1 各组小鼠EL与NCP比较(±s)

2.2 各组小鼠尿液总离子流图 QC样本的总离子流色谱图(TIC)见图1。观察发现仪器的保留时间重现较好，仪器稳定，因而提高了仪器分析和数据结果的可靠性。

图1 QC样本总离子流色谱图

2.3 各组小鼠尿液1H-NMR模式识别分析 每组小鼠的积分值采用OPLS-DA方法对两组间差异化合物进行比较分析，可看出normal组与model组、HQ-L组与model组、HQ-M组与model组、HQ-H组与model组、Aricept组与model组分布的区域完全分开、无交叉。各组的Q2值依次为0.774、0.812、0.845、0.832、0.766，Q2值均大于0.4，可以认为模型预测结果良，说明两组间代谢物均有差异。详见图2～图9。

图2 model组与normal组尿液1H-NMR模式识别分析

图3 HQ-L组与model组尿液1H-NMR模式识别分析

图4 HQ-M组与model组尿液1H-NMR模式识别分析

图5 HQ-H组与model组尿液1H-NMR模式识别分析

图6 Aricept组与model组尿液1H-NMR模式识别分析

图7 HQ-L组与Aricept组尿液1H-NMR模式识别分析

图8 HQ-M组与Aricept组尿液1H-NMR模式识别分析

图9 HQ-H组与Aricept组尿液1H-NMR模式识别分析

2.4 潜在生物标记物分析

2.4.1 潜在生物标记物的选择 样品因子载荷显示有4种产物的载荷图荷质比距离在0.006 以上，且与其余相关产物相比较，具有显著优势。故本实验采用对分类贡献较大的这4种物质作为特征生物标记物。

2.4.2 潜在生物标记物的鉴别 通过标定相应编号质谱峰的质荷比和保留时间，采用正离子检索模式即加氢、加水或加乙腈，以误差5 μg/mL(5 ppm) 以内，同位素峰匹配度不低于95%为匹配条件并结合统计分析方法[7]筛选特征代谢产物。最终鉴别出α-生育三烯酚(α-tocotrienol)、鞘氨醇激酶(sphingsine)、多巴胺(dopamine)及胆固醇(cholesterol)4种潜在生物标记物。

2.5 4种标记物的含量变化趋势 将鉴定出的物质在各个样本中的含量进行(峰面积)统计，使用单因素方差分析方法进行分析，若方差不齐使用K-W检验，若方差齐则使用 LSD 检验。在各组小鼠尿液中潜在标志物含量方面，与normal组比较，model组尿液中α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量降低，胆固醇含量均升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；与model组比较，HQ-M组、HQ-H组、Aricept组α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量均升高，胆固醇含量均降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与HQ-L组比较，HQ-M组、HQ-H组、Aricept组α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量均升高，胆固醇含量均降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与HQ-M组比较，HQ-H组α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量均升高，胆固醇含量均降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与Aricept组比较，HQ-H组α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量均升高，胆固醇含量均降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表2。

表2 4种标记物在各组小鼠尿液中的含量(峰面积)比较(±s)

2.6 各组小鼠尿液差异性代谢物相关代谢通路分析 为研究所有差异性代谢物所涉及的代谢途径及各代谢物之间的相互作用关系，参考KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库，利用MetPA分析平台对最终得到所有差异代谢物进行代谢通路富集分析。在取得差异代谢物的匹配信息后，对对应物种的通路数据库进行搜索和代谢通路分析。代谢通路分析见表3。

表3 各组小鼠差异代谢物相关的代谢通路

3 讨 论

AD的临床表现为进行性记忆减退及认知功能减退的神经退行性疾病。目前全球大约有3 700万人受累，预计每20年翻一倍，已经成为一个全球性的健康问题[8]。AD属于中医学“呆病”“善忘”等范畴。肾虚痰阻血瘀是本病的病机特点，其中肾虚为本，痰阻、血瘀为标，本虚标实。恒清Ⅱ号方是本课题组根据长期临床经验总结而来的治疗AD的经验方。该方由益智仁、黄芪、菟丝子、川芎、熟地黄、桑寄生、石决明、杜仲、地龙、天麻、钩藤11味药物组成，具有补益肾精、化痰祛浊、活血化瘀的功效，使髓海得以充养，神智得以恢复，从而治疗AD。前期经过大量临床验证，恒清Ⅱ号方治疗AD疗效确切。

从本实验结果可以看出，在改善AD小鼠认知功能方面，与model组比较，HQ-M组、HQ-H组、Aricept组小鼠EL明显缩短，NCP明显增加(P<0.01)；与HQ-L组比较，HQ-M组、HQ-H组、Aricept组小鼠的EL明显缩短，NCP明显增加(P<0.05或P<0.01)；与HQ-M组比较，HQ-H组小鼠的EL明显缩短，NCP明显增加(P<0.05)；与Aricept组比较，HQ-H组小鼠EL明显缩短，NCP明显增加(P<0.05)。恒清Ⅱ号方低、中、高剂量之间作用比较：HQ-H组>HQ-M组>HQ-L组，即恒清Ⅱ号方的量效关系呈正相关；高剂量恒清Ⅱ号方与安理申之间的作用比较，高剂量恒清Ⅱ号方的作用要优于安理申。

在AD小鼠尿液中潜在标记物方面，本研究结果表明，APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠尿液中潜在生物标志物为α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺、胆固醇；AD小鼠尿液中α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量与恒清Ⅱ号方的剂量呈正相关，AD小鼠尿液中的胆固醇含量与恒清Ⅱ号方的剂量呈负相关；高剂量恒清Ⅱ号方各剂量组小鼠尿液中α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量高于安理申组，恒清Ⅱ号方高剂量组小鼠尿液中的胆固醇含量低于安理申组。

生育三烯酚(tocotrienol)可保护神经细胞免受氧化损伤[9]。纳摩尔浓度的α-生育三烯酚是唯一可通过调节细胞死亡的特定介质而防止诱导的神经变性的试剂[10]。生育三烯酚可以消除或淬灭活性氧自由基，阻止脂质过氧化的链式反应，有效阻止氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的形成，从而抑制粥样斑块的形成[11]。催化1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)生成的酶是鞘氨醇激酶。S1P参与少突胶质细胞[12]，中枢神经系统髓鞘细胞[13]的生长和存活，以及调节神经元的兴奋性[14]。鞘氨醇激酶1的激活和S1P的形成可以保护中脑神经元免受谷氨酸诱导神经毒性的影响[15]。多巴胺参与AD的病程，主要与AD病人的精神症状有关。AD病人的尸检发现纹状体、杏仁核、黑质、扣带回、中缝核等部位多巴胺含量降低[16]。在AD病人的脑脊液和尿液中多巴胺含量也有降低，并且与病程有明显的相关性[17]。胆固醇水平的增加可调节网格蛋白介导的APP内吞作用，从而导致Aβ42分泌增加，诱导形成类似于AD大脑受影响神经元中增大的早期内涵体，增大的早期内涵体表明胆固醇是AD的潜在治疗靶标[18]。神经元中胆固醇浓度增加可能导致体内神经变性及神经元凋亡，从而导致认知障碍。淀粉样蛋白病理学改变在AD临床症状发作前至少20年已经发生[19]。

恒清Ⅱ号方抗AD作用的相关代谢通路方面，通过对生物标志物的分析，发现恒清Ⅱ号方的抗AD作用主要涉及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径，牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径，半胱氨酸和蛋氨酸代谢及三羧酸循环，即氨基酸生物合成、氨基酸代谢以及能量代谢等途径。①缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸属于支链氨基酸，是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的三大必需氨基酸，具有促进蛋白质合成、抑制蛋白质分解的多种生理功能。②牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径：牛磺酸具有促进脑发育，改善学习记忆能力，提高神经纤维传导，抗脂质过氧化能力，保护神经细胞的作用[20]。牛磺酸可以减少锰致大鼠的神经细胞损害，改善空间记忆能力，减少氧化损伤[21]。③甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径：甘氨酸作为脑内最为重要的兴奋性神经递质，可激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)，进而联合作用于谷氨酸介导的神经传递，NMDA受体的激活，对于学习记忆能力的维持以及长时程增强起着重要的作用[22]。④半胱氨酸和蛋氨酸代谢：高水平同型半胱氨酸可能通过损伤血管内皮、激活NMDA受体及磷酸化tau蛋白或抑制蛋白磷酸酶-2A活性，从而引起氧化应激、增加细胞毒性和β淀粉样蛋白(Aβ)的沉积等多途径或环节，最终导致痴呆的发生[23]。④三羧酸循环作为三大营养素(糖类、脂类、氨基酸) 的最终代谢通路，是机体获得能量的主要方式。它是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，分布在线粒体内。

综上所述，恒清Ⅱ号方可以改善AD小鼠的认知功能，且呈量效关系；其剂量与AD小鼠尿液潜在生物标记物α-生育三烯酚、鞘氨醇激酶、多巴胺含量呈正相关，与胆固醇含量呈负相关，其作用与氨基酸的生物合成、氨基酸代谢以及能量代谢等代谢通路有关。