耿延会，边盈盈，裴文锋，刘国元，吴嫚，臧新山，李丹，李兴丽，Zhang Jinfa，于霁雯*

（1.棉花生物学国家重点试验室/ 中国农业科学院棉花研究所/ 农业部棉花生物学与遗传育种重点试验室，河南安阳455000；2.新墨西哥州立大学，新墨西哥州 拉斯克鲁塞斯88003，美国）

植物几乎所有的能源来自阳光，光合作用是植物叶片获取光能最重要的途径，叶片中的叶绿体是光合作用最主要的细胞器，叶绿素是植物吸收、传递、转化光能的重要色素[1]。在一定程度上，增加叶绿素含量可以增强叶绿体对光能的吸收与转化，增强光合速率，从而提高产量[2]。 植株生长后期叶绿素含量较高的品种， 叶片功能期较长，不易早衰[3]。棉花叶片叶绿素含量可能与抗逆性和纤维品质有关[4-6]，并受棉花半配子基因调控[7]。 另外，研究表明叶绿素含量受光照强度、温度、水分、生育期、植株部位、水肥条件、盐胁迫等因素的影响[8-12]，因此叶绿素含量可以作为植株生理状况的1 项重要指标。

叶绿体发育受到抑制， 叶绿素含量降低，叶片会表现出黄化、白化等现象[13]，芽黄突变体v1苗期叶片呈黄色， 叶绿素含量比野生型低3～5倍[14]，后期发育过程中叶绿素含量逐渐增加使芽黄突变体v1叶色与野生型棉株没有明显差异[15]。为探究棉花叶绿素形成的遗传机制，前人利用不同棉花群体对叶绿素含量进行QTL 定位。 秦鸿德等[3]报道了棉花叶绿素含量和光合速率相关QTL， 定位到3 个与叶绿素含量相关的QTLs；Song 等[14]检测到24 个与叶绿素相关的QTLs；张建等[16]定位到6 个与叶绿素含量相关的QTLs；郑巨云等[17]定位到1 个关于叶绿素含量的QTL；戎福喜等[18]定位到1 个关于叶绿素含量相关的QTL；Abdelraheem 等[5]共定位到18 个与叶绿素含量相关的QTLs。 统计发现，前人鉴定到32 个与叶绿素含量相关的QTLs[5]。 然而，以上研究大多基于F2等初级分离群体， 且使用的SSR 标记数量有限，构建的遗传图谱密度较低，不能覆盖棉花全基因组。 此外，前人研究中对叶绿素含量测定主要集中在棉花的营养生长期， 如苗期；而对棉花从营养生长过渡到生殖生长的开花期、以及生殖生长的结铃期叶绿素含量的研究较少。 目前对植物叶绿素含量测定方法可归纳为化学法和物理法。 其中化学法主要是利用乙醇或丙酮有机溶剂萃取叶绿素，并通过分光光度计进行叶绿素含量测定；但该法操作繁琐，不利于进行大规模的样本测定，且提取过程中很难避免叶绿素的分解损失。 物理法可通过叶绿素测定仪例如日本研发的SPAD-502 来检测叶绿素含量的相对值；该方法适合在室外对植物叶绿素含量指标进行随身携带快速测定。 此外，大量研究表明该仪器测定的SPAD （Soil and plant analyzer development，土壤与作物分析仪开发）读值与叶绿素含量之间具有良好的相关性，目前已广泛应用于水稻、小麦、棉花、菘蓝、西瓜等植物的叶绿素含量的快速测定和QTL 定位[17,19-22]。

本研究利用叶色浅绿的陆地棉中36 和叶色深绿的海岛棉海7124 构建高世代棉花陆海回交自交系群体 （Interspecific backcross inbred line,BIL），分别对BC1F7群体的195 个家系初花期和结铃期的叶绿素含量指标SPAD 值进行统计分析；利用本课题已构建的该群体高密度遗传图谱数据分别对初花期和结铃期的叶绿素含量性状进行QTL 定位， 以期鉴定出与叶绿素含量相关的QTL， 为叶绿素含量相关QTL 的精细定位奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以广适应性叶色较浅的陆地棉材料中36 为轮回亲本与抗黄萎病、黄花、黄色花药、花基红心、 叶色较深的海岛棉海7124 材料杂交得到BC1F1， 并连续自交7 代后， 最终得到包含195 个家系的BC1F7回交自交系群体。 该群体及其亲本分别于2017 年种植于中国农业科学院棉花研究所南试验场试验田 （N36.06°，E114.49°），采用完全随机区组试验设计，2 个重复（分别位于地势较低、 水肥较好的偏东位置和地势较高、水肥相对较差的偏西位置）。 两亲本及其195 个家系种植行长4 m，行间距约80 cm，株距约25 cm，采取常规田间管理。

1.2 叶绿素含量指标SPAD 值测定

在初花期（时期1）和结铃期（时期2）分别对亲本及BC1F7群体的195 个家系进行叶绿素含量指标SPAD （Soil and plant analyzer development，土壤与作物分析仪开发）值测定。 在晴天上午7∶00―9∶00 利用叶绿素测定仪（SPAD-502 Plus，Konica minolta,Japan）对每行中间部分随机挑选的3 株生长健康的棉花主茎倒4 叶进行SPAD 值测定。由于SPAD 值与叶绿素含量（质量分数）显著相关符合公式：y＝1.01513x－1，x 和y分别代表SPAD 值和叶绿素质量分数[23]，因此本试验以SPAD 值作为叶绿素含量指标进行试验分析。

1.3 数据分析和QTL 定位

1.3.1 表型数据分析。 利用SAS 9.3 软件对初花期和结铃期的叶片SPAD 值表型数据进行最大值、最小值、平均值、峰度、偏度、正态分布检验等描述性统计分析； 用proc anova 进行方差分析；用SAS 9.3 软件的简单线性相关模型对2 个时期的叶绿素含量性状进行相关性分析。 用Origin 2018 软件进行绘图。

1.3.2 QTL 定位。本研究采用以下2 种分析模型对叶绿素SPAD 值性状进行QTL 定位：1） 利用IciMapping 4.1 软件的BIP 模型的完备区间作图法（Inclusive composite interval mapping，ICIM）分别对初花期、结铃期的叶绿素含量性状进行QTL定位，本方法以LOD＝2.0 为阈值；2）为研究棉花营养生长过渡到生殖生长的初花期与棉花生殖生长的结铃期叶片叶绿素含量性状QTL 的加性与环境互作效应， 本研究对利用IciMapping 4.1软件的MET 模型进行分析，该方法以LOD＝3.0为阈值。 QTL 的命名规则：q＋性状的英文缩写-染色体号-数字。

2 结果与分析

2.1 BILs 群体及其亲本叶绿素含量指标SPAD值的描述性统计分析

对BILs 群体及其亲本的主茎倒4 叶的叶绿素含量指标SPAD 值进行了基本统计，发现在初花期亲本中36 和海7124 的叶片SPAD 值分别为47.15 和46.90，BILs 群 体 的 SPAD 值 为35.43～53.52（图1），变异系数为6.75%（表1）；结铃期亲本中36 和海7124 的SPAD 值分别为52.95 和51.60， 群体的SPAD 值为42.28～62.20（图1），变异系数为7.18%（表1）。 该群体在2 个时期的叶绿素含量相关的SPAD 值均表现出超亲分离现象；2 个时期的叶片SPAD 值的变异系数均高于6%， 说明叶绿素含量相关的SPAD 值在该群体中的变异较为丰富。 此外，通过对2 个时期SPAD 值的峰度进行分析，发现初花期和结铃期的峰度分别为0.09 和0.07， 说明该群体SPAD 值在2 个时期均符合正态分布（表1）。 以上SPAD 值的统计分析为进一步对2 个时期叶绿素含量相关性状的QTL 定位奠定基础。

图1 BIL 群体SPAD 值频率分布图Fig. 1 Frequency distribution of SPAD value for BIL population

表1 亲本和BIL 群体的SPAD 值表型测定Table 1 Phenotypic determination of SPAD value in parents and BIL population

分别对初花期、结铃期2 个时期以及不同时期2 个重复间的SPAD 值进行方差分析，发现不同时期和不同重复的叶绿素含量指标SPAD 值都存在极显著差异（表2 和图2）。 不同时期的叶片SPAD 值差异极显著表明每个家系在初花期（从营养生长过渡到生殖生长）与结铃期（棉花生殖生长）的叶绿素含量变化一致性较弱；2 个重复间存在极显著差异表明该性状受土壤水肥等因素影响较大。 进一步分析发现初花期和结铃期的遗传力分别为66.84%和69.66%（表1）， 说明叶绿素含量性状相关SPAD 值在2 个时期主要受基因型控制，但也易受环境因素的影响。

表2 BIL 群体中SPAD 值的方差分析Table 2 Analysis of variance for SPAD value in BIL population

图2 BIL 群体两重复间SPAD 值差异分析Fig. 2 Differential analysis of SPAD value of BIL population between two replicates at two stages

2.2 初花期和结铃期叶绿素含量指标SPAD 值之间的相关性分析

为研究棉花初花期和结铃期的叶绿素含量的关系， 对初花期和结铃期的叶绿素含量SPAD值进行相关性分析发现，初花期叶绿素含量与结铃期叶绿素含量SPAD 值呈正相关关系，相关系数为0.057，但未达到显著水平。 这表明该陆海回交自交系群体初花期叶绿素含量与生殖生长阶段结铃期的叶绿素含量的一致性相对较弱，以及对不同时期叶绿素含量进行调查和QTL 定位的必要性。

2.3 BIL 群体叶绿素含量性状 （SPAD 值）的QTL 定位

2.3.1 叶绿素含量指标SPAD 值的QTL 分析。由于初花期和盛花期的叶绿素含量指标SPAD值以及重复间存在显著差异（图2），因此本研究把2 个时期和2 个重复的数据作为4 个独立环境的性状分别进行定位分析。 根据构建的高密度遗传图谱[24]，利用IciMapping 4.1 软件的BIP 单环境算法，共检测到位于A04、A10、A11、D08 和D10 染色体的7 个与叶绿素含量相关的QTLs（表3），其中在初花期检测到4 个QTLs，在结铃期检测到3 个QTLs，LOD 值为2.15～2.77，解释表型变异率为4.86%～5.98%， 加性效应为－1.16%～1.15%，其中正效应来自海7124 能够增加叶绿素含量， 负效应来自中36 能够减少叶绿素含量。 通过比较不同时期叶绿素含量相关QTL 发现， 初花期叶绿素含量显著相关的q-SPAD-A11-1 （位于A11 染色体的86.97 Mb～87.97 Mb） 与结铃期叶绿素含量显著相关的q-SPAD-A11-2 （位于A11 染色体的83.50 Mb～90.29 Mb）具有较大重叠。 该结果表明A11 染色体具有1 个稳定的调控叶绿素含量性状的QTL，反应了本研究分析结果的可靠性。

2.3.2 两个时期叶绿素含量指标SPAD 值的联合QTL 分析。 对初花期和结铃期的叶绿素含量指标SPAD 值分析发现，2 个时期叶绿素性状的遗传力分别为66.84%和69.66%（表1）， 即该性状受环境因素的影响率超过30%。 为揭示棉花叶绿素含量主效QTL 与环境的互作效应， 本研究将初花期和结铃期的叶绿素含量指标SPAD 值用IciMapping 4.1 软件的MET 模型进行基因型与环境互作分析。 共检测到5 个QTLs（q-mSPAD-A11-1、q-mSPAD-D08-1、q-mSPADD10-1、q-mSPAD-D10-2 和q-mSPAD-D10-3） 分布在A11、D08 和D10 染色体（表4），对表型的解释率为2.34%～2.69%； 其中q-mSPAD-D08-1的加性效应值为正效应， 其余4 个QTLs 加性效应值为负效应， 说明轮回亲本中36 对该群体的叶绿素含量影响较大。 5 个QTLs 的加性效应与环境互作的LOD 值均小于0.04， 该结果表明本研究得到与叶绿素相关的主效QTL 受环境影响较小。 对BIP 模型获得的7 个叶绿素含量性状相关QTLs（表3）和MET 模型的5 个叶绿素含量性状相关QTLs 进行分析（表4），发现BIP 模型中q-SPAD-A11-2 、q-SPAD-D08-2 和q-SPADD10-1 分别与MET 模型中的q-mSPAD-A11-1、q-mSPAD-D08-1 和q-mSPAD-D10-1 一致。 通过对2 种模型的QTLs 进行整合， 本研究共得到9个与叶绿素含量性状相关的QTLs。

表3 叶绿素含量指标SPAD 值单时期的QTL 定位Table 3 Mapping quantitative trait loci of SPAD value of chlorophyll content index in a single state

表4 用MET 模型对2 个时期SPAD 值进行QTL 定位Table 4 QTL mapping i of SPAD value in two stages with MET model

3 讨论

叶绿素是植物体重要的光合色素，在植物光能利用中起核心作用。 前人研究表明，植物叶绿素的生物合成过程包含约15 个步骤， 任何1 个步骤的改变都会对叶绿素含量造成影响[25]。 叶绿素复杂的代谢过程需要大量的基因参与其中，叶绿素含量性状是复杂的数量性状。 通过对初花期和结铃期叶绿素含量指标SPAD 值的表型数据分析， 发现该性状在2 个时期的遗传力分别为66.84%和69.66%， 与棉花的纤维长度性状遗传力89.57%、 比强度遗传力82.43%相比较小[26-27]。说明与纤维品质等其它数量性状相比，叶绿素含量更易受环境因素的影响。 因此需要收集更多环境的叶绿素含量表型值才能确保对该性状定位的准确性[28]。

本研究利用陆海回交自交系群体构建的高密度遗传图谱对棉花发育过程中的初花期和结铃期叶绿素含量性状分别进行QTL 定位。 对比前人的研究结果， 本研究检测到的q-SPAD-D10-1、q-mSPAD-D10-1 和q-mSPAD-D10-2 与胡凤萍[29]的芽黄v1，及Song 等[14]、郑巨云等[17]和Abdelraheem 等[4]的叶绿素含量定位结果一致，均定位在D10 染色体 （图3）；q-SPAD-A04-1 与Abdelra heem 等[4]的叶绿素含量相关QTL 均定位到A04染色体；q-SPAD-A10-1 和q-SPAD-D08-1 与秦鸿德等[3]叶绿素含量相关QTL 的染色体定位一致（图3）； 本研究中q-SPAD-D08-2 （48.71 Mb～53.65 Mb）与秦鸿德等[3]对叶绿素含量性状定位所 得 的qSPAD-2 （ 位 于 标 记NAU3499 和NAU1505 之间）重叠（图3）。 以上结果表明了本研究定位结果的可靠性。 此外，本研究在A11 染色体鉴定到与叶绿素含量性状稳定相关的新位点（q-SPAD-A11-1 和q-SPAD-A11-2）。 该结果为进一步对叶绿素含量性状的遗传解析奠定新的基础。

4 结论

图3 叶绿素含量指标SPAD 值的QTL 定位Fig. 3 The QTL mapping of SPAD value of chlorophyll content index

本试验利用高世代陆海回交自交系群体的高密度遗传图谱，对初花期和结铃期的叶绿素含量进行QTL 定位， 最终获得9 个叶绿素含量相关的QTLs， 其中初花期叶绿素含量相关的q-SPAD-A11-1（86.97 Mb-87.97 Mb）与结铃期叶绿素含量相关的q-SPAD-A11-2（83.50 Mb-90.29 Mb）具有较大的重叠区间，为进一步的精细定位奠定基础。