程雨菲 朱晓岩 马爱军 潘旭东

[摘要] 目的 探讨褐藻糖胶对高脂喂养的ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块模型的作用及Nod样受体蛋白3（NLRP3）炎症通路蛋白表达的影响。方法 雄性ApoE-/-小鼠36只，随机分为对照组（普通饮食）、模型组（颈动脉套管+高脂饮食+生理盐水）和褐藻糖胶组（颈动脉套管+高脂饮食+褐藻糖胶），每组12只。8周后检测各组小鼠血脂水平，采用苏木精-伊红（HE）染色方法观察小鼠右侧颈总动脉病理改变，ELISA法测定炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达水平，Western Blot方法检测颈动脉粥样硬化斑块中NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）、IL-1β蛋白表达水平。结果 与模型组比较，褐藻糖胶组小鼠血脂水平明显降低，颈动脉粥样硬化易损斑块明显减少，IL-1β、IL-6、TNF-α表达降低，差异均有显著性（F=8.31～190.73，P<0.05）。模型组颈动脉粥样硬化斑块中NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表达较对照组显著升高，而褐藻糖胶组各蛋白表达较模型组下降（F=50.22～120.59，P<0.05）。结论 褐藻糖胶能够通过下调NLRP3炎性小体通路抑制炎症而发挥抗颈动脉粥样硬化作用。

[关键词] 褐藻糖胶;斑块，动脉粥样硬化;NLR家族，热蛋白结构域包含蛋白3

[中图分类号] R543.5  [文献标志码] A  [文章编号] 2096-5532（2020）05-0536-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.131 [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of fucoidan on carotid atherosclerotic vulnerable plaques and expression of Nod-like receptor family， pyrin domain-containing protein 3 （NLRP3）-related inflammatory pathway proteins in ApoE-/- mice fed with high-fat diet.  Methods A total of 36 male ApoE-/- mice were randomly divided into control group （normal diet）， model group （carotid collar+high-fat diet+normal saline）， and fucoidan group （carotid collar+high-fat diet+fucoidan）， with 12 mice in each group. After 8 weeks， blood lipid levels were measured; hematoxylin-eosin staining was used to observe the pathological changes of the right common carotid artery; ELISA was used to measure the levels of the inflammatory factors interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）; Western Blot was used to measure the protein expression of NLRP3， Caspase-1， and IL-1β in atherosclerotic plaques. Results Compared with the model group， the fucoidan group had significant reductions in blood lipid levels， carotid atherosclerotic vulnerable plaques， and expression of IL-1β， IL-6， and TNF-α （F=8.31-190.73，P<0.05）. Compared with the control group， the model group had significant increases in the protein expression of NLRP3， Caspase-1， and IL-1β in carotid atherosclerotic plaques， and compared with the model group， the fucoidan group had significant reductions in the expression of these proteins （F=50.22-120.59，P<0.05）.  Conclusion Fucoidan can effectively atte-nuate carotid atherosclerosis by downregulating the NLRP3 inflammasome pathway.

[KEY WORDS] fucoidan; plaque， atherosclerotic; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein

缺血性腦卒中是威胁人类生命的主要疾病之一[1]，其主要危险因素是颈动脉粥样硬化[2]。有研究表明，颈动脉粥样硬化是一种缓慢发展的免疫炎症反应过程[3]，从粥样硬化斑块形成、发展至斑块破裂，多种炎症细胞和炎症因子参与其中[4]。因此，探讨抑制炎症反应的干预措施以控制动脉粥样硬化发生发展，对治疗缺血性脑卒中具有重要意义。褐藻糖胶是海洋类褐藻植物中一种特有的多糖，有研究表明褐藻糖胶能够调节脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症因子释放，抑制核转录因子κB（NF-κB）活化而反应性抑制促炎基因表达[5]，但其对颈动脉易损斑块的作用及具体机制尚未有研究。Nod样受体蛋白3（NLRP3）在动脉粥样硬化发生发展过程中具有重要作用[6-8]，NLRP3基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块及炎症因子白细胞介素-1β（IL-1β）分泌明显降低[9]。本实验通过构建高脂喂养的ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块模型，观察褐藻糖胶对颈动脉斑块NLRP3炎性小体相关蛋白表达影响，探讨褐藻糖胶对颈动脉粥样硬化的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

褐藻糖胶（Sigma-Aldrich公司），用0.22 mm孔径过滤器进行过滤，并在-20 ℃条件下保存为褐藻糖胶提取物（10 g/L），直至使用。6周龄大小C57BL/6背景ApoE-/-基因敲除雄性小鼠（北京Vital River公司）36只，体质量为18～22 g，标准条件下饲养于青岛大学医学部实验动物中心，自由进食、饮水，每笼3只，适应性喂养2周后用于实验。NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）、IL-1β（CST公司），ELISA检测试剂盒（eBioscience公司），ECL显影液（Millipore公司）。

1.2 动物分组及处理

将36只小鼠随机分成对照组、模型组、褐藻糖胶组（实验组），每组12只。模型组、褐藻糖胶组小鼠于右侧颈总动脉插入颈动脉套管，并给予高脂饲料（每100.00 g饲料含胆固醇0.25 g、脂肪15.00 g）喂养制备小鼠颈动脉粥样硬化斑块模型[10]。对照组不手术，给予普通饲料喂养。模型制备后第4周褐藻糖胶组小鼠给予褐藻糖胶30 mg/（kg·d）腹腔注射，对照组及模型组腹腔注射等量生理盐水，共注射4周。所有动物研究经青岛大学附属医院实验动物管理委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院修订的《实验动物管理和使用指南》[11]。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 标本采集 小鼠禁食12 h（正常饮水），腹腔注射100 g/L水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，内眦动脉取血;处死小鼠后固定于鼠板，沿颈部正中线剪开皮肤，暴露右侧颈总动脉，然后剪下套管两端长度约0.5 cm血管。

1.3.2 血脂测定 取小鼠内眦动脉血约3 mL，3 000 r/min离心取上清，测定总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平。

1.3.3 病理观察 将离体的右侧颈总动脉用40 g/L多聚甲醛固定，乙醇脱水、浸蜡包埋、切片，苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察血管动脉粥样硬化形成情况。1.3.4 血清IL-1β、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平检测 采用ELISA方法分别检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，按试剂盒说明书操作。

1.3.5 頸动脉粥样硬化斑块组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β水平测定 应用Western Blot方法。用RIPA裂解液裂解颈动脉组织，BCA法测定蛋白质含量，SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转到PVDF膜上。室温封闭后2 h后与一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜。用TBST洗涤后，加二抗在室温下孵育1 h，ECL显影。应用图像分析软件对图像进行分析，以目的条带与GAPDH的灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组内两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结  果

2.1 各组小鼠血清脂质水平比较

模型组血清TC、TG、LDL水平与对照组比较明显升高，而褐藻糖胶组血清TC、TG、LDL水平较模型组明显降低，差异有统计学意义（F=8.31～126.25，P<0.05）。见表1。

2.2 各组小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块形成比较

光镜下可见，对照组小鼠血管未见明显粥样斑块，管壁3层结构明显，内膜完整;模型组小鼠颈动脉内见明显粥样硬化斑块形成，斑块内见泡沫细胞浸润，部分破裂，血栓形成;而褐藻糖胶组小鼠颈动脉内粥样斑块明显减轻，泡沫细胞减少。见图1。

2.3 各组小鼠血清炎症因子水平比较

模型组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达较对照组升高，褐藻糖胶组各血清炎症因子水平较模型组下降，差异有统计学意义（F=60.21～190.73，P<0.05）。见表2。

2.4 各组NLRP3炎性小体通路相关蛋白表达比较

与对照组比较，模型组小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块中NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达明显增高;与模型组比较，褐藻糖胶组NLRP3、Caspase-1、IL-1β表达降低，差异有显著性（F=50.22～120.59，P<0.05）。见图2、表3。

3 讨  论

炎症在动脉粥样硬化发生和发展以及血栓形成中起着重要的作用[3]。褐藻糖胶是以L-褐藻糖为基础的多糖，具有多种生物学功能，包括抗炎、抗血管生成、抗凝血、抗肿瘤等，是天然海洋药物研究的热点[12-14]。然而，褐藻糖胶在动脉粥样硬化中的作用及其机制尚不清楚。本文利用颈动脉套管合并高脂饲料饲养构建ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块模型，探讨褐藻糖胶对ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化的作用及其机制。

有研究结果显示，褐藻糖胶可以调节高脂喂养ApoEshl小鼠血脂水平及动脉粥样硬化进展[15]。本文结果与其一致。本文结果显示，褐藻糖胶干预后小鼠血清TC、TG和LDL水平较模型组明显降低;病理观察显示，与对照组相比，模型组颈动脉血管内壁有大量脂质及泡沫细胞堆积，血管腔严重堵塞，而褐藻糖胶组颈动脉血管内壁斑块面积及脂滴明显减少，提示褐藻糖胶能够缓解小鼠颈动脉粥样硬化易损斑块的发生和进展。TNF-α介导全身炎症和免疫反应，在慢性炎症性疾病的发生发展过程中均发挥作用[16-17]。IL-6及IL-1β都是促炎性细胞因子，可刺激炎症的产生，促进免疫性疾病的发生，在动脉粥样硬化过程中起到重要作用[18-20]。有研究显示，褐藻糖胶能够调节LPS诱导的巨噬细胞释放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子[21]。本文ELISA检测显示，褐藻糖胶能够明显降低ApoE-/-小鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌。表明褐藻糖胶能够通过抑制炎症反应而发挥抗动脉粥样硬化作用。

研究表明，褐藻糖膠能够影响炎症因子IL-1β表达，而在众多调节炎性因子IL-1β成熟和分泌的通路中，NLRP3炎性小体依赖性的经典通路尤为重要[7，20]。NLRP3炎症小体是NLRs家族中的一员，是由感受蛋白NLRP3、衔接蛋白凋亡相关斑点样蛋白ASC和效应蛋白激酶Caspase-1等组成的复合物[22-23]。已有研究显示，胆固醇结晶、氧化低密度脂蛋白、血流动力异常都会激活单核巨噬细胞NLRP3炎症小体，进而诱导Caspase-1介导的炎性细胞因子IL-1β的成熟分泌，导致心脑血管疾病和事件的发生[24]。因此，抑制NLRP3炎性小体能够控制动脉粥样硬化的发展，稳定动脉粥样硬化斑块，降低因不稳定斑块造成的缺血性脑卒中的风险。本文采用Western Blot方法检测小鼠颈动脉粥样硬化斑块组织NLRP3炎性小体及IL-1β水平，结果显示，与模型组相比较，褐藻糖胶组NLRP3蛋白的表达降低，Caspase-1蛋白及下游炎性细胞因子IL-1β表达减少，一定程度上表明褐藻糖胶能够通过下调NLRP3炎性小体相关蛋白表达而发挥抗炎作用。

综上所述，褐藻糖胶能够通过下调NLRP3炎性小体通路抑制炎症而发挥抗颈动脉粥样硬化作用。本文结果可为抗动脉粥样硬化辅助治疗提供候选药物。

[参考文献]

[1] LOPEZ A. Measuring the global burden of disease[J]. The New England Journal of Medicine， 2013，369（5）：448-457.

[2] GBD 2016 Stroke Collaborators. Global， regional， and national burden of neurological disorders，1990—2016： a systematic ana-lysis for the Global Burden of Disease Study 2016[J]. The Lancet Neurology， 2019，18（5）：459-480.

[3] HANSSON G K， HERMANSSON A. The immune system in atherosclerosis[J]. Nat Immunol， 2011，12（3）：204-212.

[4] TOUSOULIS D， OIKONOMOU E， ECONOMOU E K， et al. Inflammatory cytokines in atherosclerosis：current therapeutic approaches[J]. Eur Heart J， 2016，37（22）：1723-1732.

[5] ASANKA SANJEEWA K K， JAYAWARDENA T U， KIM H S， et al. Fucoidan isolated from Padina commersonii inhibit LPS-induced inflammation in macrophages blocking TLR/NF-κB signal pathway[J]. Carbohydr Polym， 2019，224：115195.

[6] DUEWELL P， KONO H， RAYNER K J， et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals[J]. Nature， 2010，464（7293）：1357-1361.

[7] HOSEINI Z， SEPAHVAND F， RASHIDI B， et al. NLRP3 inflammasome： Its regulation and involvement in atherosclerosis[J]. J Cell Physiol， 2018，233（3）：2116-2132.

[8] MANGAN M S J， OLHAVA E J， ROUSH W R， et al. Targeting the NLRP3 inflammasome in inflammatory diseases[J]. Nat Rev Drug Discov， 2018，17（9）：688-695.

[9] ZHENG F， XING S S， GONG Z S， et al. Silence of NLRP3 suppresses atherosclerosis and stabilizes plaques in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Mediat Inflamm， 2014（4）：507-518.

[10] SUDIRMAN S， ONG A D， CHANG H W， et al. Effect of fucoidan on anterior cruciate ligament transection and medial meniscectomy induced osteoarthritis in high-fat diet-induced obese rats[J]. Nutrients， 2018，10（6）：686.

[11] LIBBY P， LICHTMAN A H， HANSSON G K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis：from mice to humans[J]. Immunity， 2013，38（6）：1092-1104.

[12] YANG X， WANG S， TRANGLE S S， et al. Investigation of different molecular weight fucoidan fractions derived from new zealand Undaria pinnatifida in combination with GroA therapy in prostate cancer cell lines[J]. Marine Drugs， 2018，16（11）：454.

[13] LI X J， YE Q F. Fucoidan reduces inflammatory response in a rat model of hepatic ischemia-reperfusion injury[J]. Can J Physiol Pharmacol， 2015，93（11）：999-1005.

[14] PARK J， CHA J D， CHOI K M， et al. Fucoidan inhibits LPS-induced inflammation in vitro and during the acute response in vivo[J]. International Immunopharmacology， 2017，43：91-98.

[15] YOKOTA T， NOMURA K， NAGASHIMA M， et al. Fucoidan alleviates high-fat diet-induced dyslipidemia and atherosclerosis in ApoE（shl） mice deficient in apolipoprotein E expression[J]. J Nutr Biochem， 2016，32（3）：46-54.

[16] TAY C， LIU Y H， HOSSEINI H， et al. B-cell-specific depletion of tumour necrosis factor alpha inhibits atherosclerosis development and plaque vulnerability to rupture by reducing cell death and inflammation[J]. Cardiovascular Research， 2016，111（4）：385-397.

[17] OBEROI R， VLACIL A K， SCHUETT J， et al. Anti-tumor necrosis factor-α therapy increases plaque burden in a mouse model of experimental atherosclerosis[J]. Atherosclerosis， 2018，27（7）：80-89.

[18] LARSSON P T， HALLERSTAM S， ROSFORS S， et al. Circulating markers of inflammation are related to carotid artery atherosclerosis[J]. Int Angiol： a J Int Union Angiol， 2005，24（1）：43-51.

[19] SONG L， SCHINDLER C. IL-6 and the acute phase response in murine atherosclerosis[J]. Atherosclerosis， 2004，177（1）：43-51.

[20] GREBE A， HOSS F， LATZ E. NLRP3 inflammasome and the IL-1 pathway in atherosclerosis[J]. Circ Res， 2018，122（12）：1722-1740.

[21] YU H H， CHENGCHUAN KO E， CHANG C L， et al. Fucoidan inhibits radiation-induced pneumonitis and lung fibrosis by reducing inflammatory cytokine expression in lung tissues[J]. Marine Drugs， 2018，16（10）：392.

[22] DAVIS B K， WEN H T， TING J P Y. The inflammasome NLRS in immunity， inflammation， and associated diseases[J]. Annu Rev Immunol， 2011，29：707-735.

[23] SWANSON K V， DENG M， TING J P Y. The NLRP3 inflammasome： molecular activation and regulation to therapeutics[J]. Nat Rev Immunol， 2019，19（8）：477-489.

[24] ABDERRAZAK A， COUCHIE D， MAHMOOD D F， et al. Anti-inflammatory and antiatherogenic effects of the NLRP3 inflammasome inhibitor arglabin in ApoE2.Ki mice fed a high-fat diet [J]. Circulation， 2015，131（12）：1061-1070.

（本文編辑 黄建乡）