彭银虓，余 彬，秦 辉，薛 力，梁益建

(四川省成都市第三人民医院骨科，四川成都 601131)

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的骨肿瘤类型，可导致约9%的患者死亡[1-2]。化疗和手术治疗可将骨肉瘤5年生存率提高60%～70%，然而，复发时合并肿瘤转移的患者5年生存率低于30%[3-4]。因此，探索骨肉瘤的转移机制对于改善患者预后具有重要意义。肿瘤转移始于上皮间质转化(EMT)，EMT是上皮细胞获得间充质表型并具有迁移和侵袭能力的过程[5]。上皮标志物E-钙黏蛋白的缺失和间充质标志物的表达增加是EMT的特征改变。EMT促进原代上皮样肿瘤细胞在转移、进展期间获得侵袭性间充质表型，从而引发肿瘤的扩散和血管浸润[6]。EMT相关基因可作为骨肉瘤的潜在标志物和治疗靶标。然而，EMT与骨肉瘤免疫微环境间的关系报道较少。骨肉瘤表达数据中EMT相关基因特征的细胞起源，EMT和免疫活动如何共同影响骨肉瘤患者的生存预后等问题目前尚不明确。本研究基于来自3个独立微阵列数据集的基因表达和临床数据，以及本院临床标本的基因表达验证，探讨了骨肉瘤中EMT相关基因的来源及与患者生存预后的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1公共数据库数据 从Gene Expression Omnibus数据库(GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[7-9]中获得3个独立的微阵列数据集(GSE36001、GSE39055和GSE16091)。GSE36001包含19例骨肉瘤标本和6例基质标本，GSE39055和GSE16091分别包含37例和34例骨肉瘤标本。

1.1.2病理组织标本 病理组织标本来源于2018-2019年本院骨科确诊为骨肉瘤的患者，共5例。于术中分别取骨肉瘤组织和基质组织作为骨肉瘤标本与基质标本，标本收集后采用RNA保护液储存，置于-80 ℃冰箱保存待测。纳入标准：(1)经CT或MRI等检查明确诊断为骨肉瘤；(2)术前未进行化疗或放疗；(3)临床资料完整。

1.1.3试剂 Trizol试剂购自Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司；PCR仪为赛默飞世尔科技有限公司生产的Applied Biosystems 7300；实时荧光定量PCR引物于Primer Bank网站在线获取，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2方法

1.2.1EMT评分 EMT相关基因标记包含从分子特征数据库标记基因集(MSigDB，software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)中获得的200个基因[10]。对于肿瘤基因组图谱中的每个标本，基于EMT相关基因表达，通过单样本基因集富集分析(ssGSEA)在R3.6.1软件中计算EMT评分[11]。

1.2.2免疫评分、基质评分和肿瘤纯度 GSE39055和GSE16091用于探讨骨肉瘤EMT、免疫活性、基质活性和肿瘤纯度间的相关性。使用R3.6.1软件的ESTIMATE软件包来评估免疫评分和基质评分[12]，用于反映免疫活性与基质活性。采用ESTIMATE软件包定义免疫细胞和基质细胞基因特征，从基因表达数据推断免疫成分和基质成分的比例，并将这些单个组分组合以评估肿瘤纯度。

1.2.3生存分析 GSE39055的总生存率和无病生存率数据用于生存分析。分别采用EMT评分、免疫评分的中位数作为高/低EMT评分和高/低免疫评分的界值[13]。

1.2.4EMT相关基因和基质细胞基因的表达分析 GSE36001用于EMT相关基因和基质细胞基因的表达分析。计算骨肉瘤标本和基质标本之间EMT相关基因和基质细胞基因的倍数变化(FC)。

1.2.5实时荧光定量PCR 使用实时荧光定量PCR检测本院5例骨肉瘤标本和5例基质标本中25种基因的表达水平。方法：Trizol法提取组织总RNA，反转录为cDNA，使用实时荧光定量PCR进行cDNA模板定量。

2 结 果

2.1骨肉瘤中EMT评分、免疫评分、基质评分和肿瘤纯度间的相关性 GSE39055和GSE16091中，EMT评分与免疫评分、基质评分均呈正相关(P<0.05)，与肿瘤纯度均呈负相关(P<0.05)，见图1中A～F；肿瘤纯度与免疫评分、基质评分均呈负相关(P<0.05)，见图1中G～J。

2.2不同EMT评分、免疫评分骨肉瘤患者的生存分析 GSE39055中，高EMT评分患者总生存率、无病生存率均低于低EMT评分患者(P<0.05)，高EMT评分是骨肉瘤患者总生存率、无病生存率下降的危险因素(HR=4.977，P=0.003；HR=4.308，P=0.010)，Kaplan-Meier生存曲线见图2A、2B；高免疫评分与低免疫评分患者总生存率、无病生存率差异无统计学意义(P>0.05)，免疫评分不是骨肉瘤患者总生存率、无病生存率下降的危险因素(HR=0.405，P=0.173；HR=0.482，P=0.134)，Kaplan-Meier生存曲线见图2C、2D。

注：A、B分别为GSE39055和GSE16091中EMT评分与免疫评分的相关性；C、D分别为GSE39055和GSE16091中EMT评分与基质评分的相关性；E、F分别为GSE39055和GSE16091中EMT评分与肿瘤纯度的相关性；G、H分别为GSE39055和GSE16091中免疫评分与肿瘤纯度的相关性；I、J分别为GSE39055和GSE16091中基质评分与肿瘤纯度的相关性。

注：A、B分别为EMT评分与骨肉瘤患者总生存率、无病生存率的Kaplan-Meier生存曲线；C、D分别为免疫评分与骨肉瘤患者总生存率、无病生存率的Kaplan-Meier生存曲线。

2.3EMT相关基因和基质细胞基因的表达和预后意义 为了探讨骨肉瘤中EMT相关基因和基质细胞基因表达间的关系，本研究分析了数据集中基因的表达和临床结局。GSE36001中，骨肉瘤标本EMT相关基因表达水平高于基质细胞基因(P<0.05)，见图3A。骨肉瘤标本和基质标本之间EMT相关基因的FC高于基质细胞基因(P<0.05)，见图3B。根据EMT和基质特征评估了单个基因的预后意义，结果显示，在GSE39055中，与骨肉瘤患者总生存率最相关的前15个基因有10个来自EMT相关基因，与骨肉瘤患者无病生存率最相关的前15个基因有11个来自EMT相关基因，见图3C、3D。

注：A为GSE36001中EMT相关基因和基质细胞基因的表达水平比较；B为GSE36001中EMT相关基因和基质细胞基因的FC比较；C为GSE39055中与骨肉瘤患者总生存率最相关的前15个基因；D为GSE39055中与骨肉瘤患者无病生存率最相关的前15个基因。

2.4验证基质细胞是骨肉瘤EMT相关基因表达的关键来源 为了验证骨肉瘤中EMT相关基因表达的关键来源，采用实时荧光定量PCR检测本院5例骨肉瘤标本与5例基质标本中上述25种基因的表达水平，包括18种EMT相关基因(ABI3BP、AREG、CADM1、CDH6、COL1A1、COL4A2、FGF2、GPX7、LAMA2、LEPRE1、MATN3、SERPINE2、SERPINH1、SNAI2、SPARC、THY1、VCAN、VIM)，3种基质细胞基因(CD86、IL18R1、SPON1)及4种基质细胞基因和EMT相关基因(COMP、GREM1、MMP3、SGCD)。结果显示，骨肉瘤标本中EMT相关基因表达水平高于基质细胞基因(P<0.05)，见图4A；基质标本中基质细胞基因表达水平高于EMT相关基因(P<0.05)，见图4B；骨肉瘤标本和基质标本之间EMT相关基因的FC高于基质细胞基因(P<0.05)，见图4C。

注：A为骨肉瘤标本中EMT相关基因与基质细胞基因表达水平比较；B为基质标本中EMT相关基因与基质细胞基因表达水平比较；C为EMT相关基因与基质细胞基因的FC比较。

3 讨 论

EMT是骨肉瘤转移的关键因素[3-5,14]，且越来越多的证据表明，EMT与人类肿瘤的免疫活性有关[15-16]，但在骨肉瘤中相关报道较少。本研究在GSE39055和GSE16091数据集中基于基因表达定义了EMT的基因特征、免疫活性和基质活性，并进一步分析了EMT、免疫活性、基质活性和肿瘤纯度间的相关性，结果显示，骨肉瘤中EMT评分和免疫评分、基质评分均呈正相关，而肿瘤纯度与EMT评分、免疫评分和基质评分均呈负相关，这些发现与尿路上皮癌和结直肠癌的最新相关研究结果一致[5,17-18]。

本研究结果显示，高EMT评分是骨肉瘤患者总生存率、无病生存率下降的危险因素；且在GSE39055中，与骨肉瘤患者总生存率最相关的前15个基因有10个来自EMT相关基因，与骨肉瘤患者无病生存率最相关的前15个基因有11个来自EMT相关基因，提示EMT相关基因的表达与骨肉瘤患者的生存预后密切相关。此外，本研究发现，免疫评分不是骨肉瘤患者总生存率、无病生存率下降的危险因素。WANG等[5]在尿路上皮癌中的相关研究也发现，免疫评分不是患者生存率下降的危险因素，与本研究结果相似，提示在不同肿瘤类型中，免疫活性可能均不会影响患者的生存率。

为了进一步探索骨肉瘤中EMT相关基因的表达细胞来源，本研究分析了GSE36001数据集和本院5例骨肉瘤标本与5例基质标本中EMT相关基因、基质细胞基因的表达差异。骨肉瘤标本中EMT相关基因表达水平高于基质细胞基因；基质标本中基质细胞基因表达水平高于EMT相关基因；骨肉瘤标本和基质标本之间EMT相关基因的FC高于基质细胞基因。同时，EMT评分与基质评分呈正相关这一结果提示骨肉瘤标本中基质细胞越多，EMT相关基因表达越高，所以，基质细胞是骨肉瘤中EMT相关基因表达的关键来源。通过使用尿路上皮癌数据集，WANG等[5]研究发现，基于基因表达的浸润性T细胞和EMT水平呈正相关，基质细胞是尿路上皮癌中EMT相关基因的主要表达细胞。ISELLA等[17]研究发现，EMT相关基因在基质细胞中高表达，表明EMT相关基因可能来源于基质细胞而非上皮癌细胞。

4 结 论

骨肉瘤中EMT、免疫活性、基质活性和肿瘤纯度之间存在相关性；EMT相关基因的表达与骨肉瘤患者的生存预后密切相关；基质细胞是骨肉瘤中EMT相关基因表达的关键来源。