蒋 敏，刘 朋，李 恒，李 会，史劲松

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214000）

药食用真菌多糖是一种从药食用真菌的子实体、菌丝体或发酵液中分离得到的，由10个以上单糖单元构成的天然高分子聚合体。研究表明，药食用真菌多糖不仅来源广泛、安全性良好，还具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖血脂等多种生理活性，因此在医药学和食品科学领域受到了广泛关注[1-3]。目前，市场上已有多个品种的药食用真菌多糖来源的药品和保健品，如灵孢注射液、香菇多糖片等。

灰树花又名栗子蘑，日本称舞茸，其香味浓郁、质地脆嫩，营养价值高，在我国有悠久的食用历史[4]。本学院生物制药研究室致力于灰树花真菌深层发酵以及药理学应用开发，建立了稳定的发酵与提取工艺[5-7]。依托于该成果，围绕生物特色，将微生物发酵与制剂技术、药理学评价相结合，开设了制药综合性实验，旨在彰显我院生物制药特色，促进学生掌握生物制药基本技术并提高综合科研素养。

1 材料与方法

1.1 实验材料

灰树花的深层发酵培养以及粗多糖参考崔凤杰等[4-5]的方法。

培养基：PDA培养基（成分g/L）：马铃薯200，葡萄糖 20，蛋白胨 2，KH2PO42，MgSO4·7 H2O 1，琼脂20。

种子培养基（成分g/L）：葡萄糖20，蛋白胨2，KH2PO42，MgSO4·7 H2O 1，麸皮浸汁 50。

发酵培养基（成分g/L）：葡萄糖30，蛋白胨4，KH2PO44，MgSO4·7 H2O 2，玉米浆 1.5。

15 L发酵罐发酵扩大培养，培养条件为25 ℃，通气量0.75 vvm，搅拌转速80 r/min，装液量60%，发酵时间为10 d，发酵结束后，离心，收集沉淀，去离子水清洗3次，称取湿菌体，提取温度89.7 ℃，时间2.48 h，水料比31.1∶1，组织粉碎机匀浆，热水加热浸提，取上清，真空浓缩后按比例加入95%乙醇，4 ℃搅拌过夜，离心收集醇沉物，真空60 ℃干燥至恒重，备用。

灰树花（Grifola frondosa GF9801）为本学院研究室保藏菌种；四氧嘧啶（160 mg/kg BW ip），用前新鲜配置；血糖试纸。

1.2 实验仪器

血糖仪；蒸汽灭菌锅；摇床；15 L发酵罐；生化培养箱；三维混匀仪；摇摆式制粒机；烘箱；真空干燥箱；压片机；电子天平；脆碎度仪；崩解仪；紫外分光光度计。

1.3 实验动物

ICR雄性小鼠（20±2 g），由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，饲养温度23 ± 2 ℃，相对湿度50 ±5 ℃，自由进食和饮水，适应性饲养1周。

2 实验方法

2.1 灰树花咀嚼片的制备

1）工艺流程。

原辅料粉碎—过筛—原辅料按比例混合—制软材—制粒—干燥—整粒—混合—压片。

2）配方比例。

赤藓糖醇 35%，灰树花粗多糖 60%，微晶纤维素5%。

3）工艺操作要点。

将灰树花粗多糖、赤藓糖醇、微晶纤维素等原料过粉碎机，过80目筛，按照配方比例称量后三维混匀仪混合15～20 min。将物料充分混匀后，70%乙醇作为黏合剂，搅拌混匀，18目筛制粒。将湿颗粒均匀分散在托盘上，烘箱烘干，直至颗粒水分控制在3 %以内。将颗粒过筛整粒，去除较小和较大的颗粒，按照配方加入0.1%硬脂酸镁，充分混匀。用自动压片机压片，制得规格为每片1.0 g的咀嚼片。

2.2 片剂质量测定

1）外观检查。[8]

取咀嚼片20片，平铺于白底板上，置于75 W光源下60 cm处，距离片剂30 cm，以肉眼观察30 s。检查结果应符合下列规定，完整光洁，色泽一致；80～120目色点应＜5%，麻面＜5%，中药粉末片除个别外应＜10%，并不得有严重花斑及特殊异物。

2）片重差异。[8]

取咀嚼片20片，精密称定并记录总质量，计算平均片质量，比较每片质量与平均片质量，超出重量差异限度（±5%）的咀嚼片不得多于 2片，并不得有 1片超出重量差异限度的1倍。

3）崩解时限。[8]

取咀嚼片6片，分别置六管吊篮的玻璃管中，每管各加1片，准备工作完毕后，进行崩解测定。

4）脆碎度测定。[9]

取20片咀嚼片，精密称定总重量，放入振荡器中振荡，到规定时间后取出，用筛子筛去细粉和碎粒，称重后计算脆碎度。

5）有效成分含量测定。

参考苯酚-硫酸法测定总糖含量。咀嚼片研磨，加入去离子水溶解，配置成 2 mg/mL溶液，吸取样品1 mL，加入5%苯酚1.0 mL，摇匀，再加5 mL浓硫酸，摇匀，静置冷却后于490 nm波长处测定吸光度[10]。

2.3 降糖效果评价

1）造模实验方法。

动物禁食24 h后，参考文献方法[11-12]，给予四氧嘧啶造模，3 d后过夜禁食，测血糖，血糖值 10～25 mmol/L为高血糖模型成功动物。

2）分组及处理。

选高血糖模型动物按过夜禁食血糖水平分成 3组，每组10只，随机分组如下：糖尿病组与对照组，给予等量生理盐水灌胃；治疗组，咀嚼片研碎并加水溶解制成每组10只。

3）空腹血糖实验。

剂量组给予咀嚼片粉末混悬液（咀嚼片研磨研磨成粉，去离子水制成混悬液），灌胃剂量为0.3 g·kg-1·d-1，模型对照组和正常对照组均给予同体积溶剂，连续灌胃给药2周，每天记录小鼠体重、饮食量与饮水量，每周定期测空腹血糖，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。

血糖下降百分率=（实验前血糖值-实验后血糖值）/实验前血糖值×100%。

4）口服糖耐量实验（OGTT）。

14 d后，小鼠禁食过夜后经口给予葡萄糖溶液（剂量为2.0 g·kg-1BW），测定0、0.5、1、2 h的血糖值，观察各组动物给予葡萄糖后各时间点血糖水平及曲线下面积的变化。

血糖曲线下面积（AUC）=15×（0 h血糖值+0.5 h血糖值）+15×（0.5 h血糖值+1 h血糖值）+15×（1 h血糖值+2 h血糖值）。

3 结果与分析

3.1 咀嚼片质量检查

制得的咀嚼片形状完整，表面光滑，色泽均匀，具有灰树花的特有香气。重量差异、脆碎度、硬度、水分均合格，粗多糖含量为（5.6±0.2）% /片。

3.2 造模情况

按照实验规范，将实验用 ICR系雄性小鼠禁食24 h（不禁水），一次性腹腔注射四氧嘧啶溶液（生理盐水溶解，一次性腹腔注射给药160 mg/kg，3 d后尾尖取血测定小鼠空腹12 h的血糖，记录数值，将给药造模3 d后的空腹血糖值＞10.0 mmol/L的小鼠视为模型建立成功并用于后续评价实验。

3.3 不同组小鼠体重情况

不同组小鼠体重情况如图1所示。图中可见，对照组小鼠体重随着时间缓慢上升，而经过四氧嘧啶诱导后，小鼠出现了糖尿病典型的体重减轻现象。观察比较模型组和咀嚼片组片，发现2组小鼠体重均随着时间缓慢上升，但是咀嚼片小鼠体重显著高于模型组，结果显示，灰树花咀嚼片能够缓减糖尿病造成的体重减轻。

图1 各组小鼠体重情况

3.4 饮食与饮水情况

造模后，相较对照组、糖尿病组和治疗组小鼠出现较显著的多饮、多食等典型糖尿病症状。但是，给予灰树花咀嚼片灌胃治疗14 d后，治疗组小鼠的饮水量显著低于糖尿病组（图2(a)），且治疗组小鼠饮食量总体低于糖尿病组（图2(b)）。这说明灰树花咀嚼片能够缓解糖尿病小鼠多饮、多食等症状。

图2 各组小鼠饮食与饮水情况

3.5 空腹血糖水平变化情况

在腹腔注射四氧嘧啶前各组小鼠血糖均无显著差异，且处于正常水平；造模3 d后给予四氧嘧啶的小鼠血糖水平均显著高于对照组，且其组间无显著差异；通过给药1周后观察可知，咀嚼片组血糖水平低于模型组（p＜0.05）；给药2周后，咀嚼片组血糖水平依旧显著低于糖尿病组（p＜0.05），如图3所示。

图3 空腹血糖水平比较分析

3.6 糖耐量实验及其曲线下面积变化情况

口服糖耐量实验（OGTT）可以观察小鼠耐受葡萄糖的能力以及小鼠β细胞功能。OGTT结果显示，糖尿病组小鼠血糖波动较大，经治疗后的小鼠血糖水平变化趋于平缓（见图 4），且各组 OGTT曲线下面积（AUC）计算结果显示（见图5），治疗组小鼠的口服糖耐量的AUC明显低于糖尿病组（p＜0.05）。这说明在经过予灰树花咀嚼片治疗后，糖尿病小鼠的血糖调节功能明显改善。

图4 口服糖耐量实验

图5 口服糖耐量曲线下面积比较分析

4 结语

本实验内容涵盖了上游原料药的发酵提取、下游制剂产品的开发与质量控制、药理学评价，实验内容丰富，通过本教学项目的实施可促进制药工程专业学生建立全产业链的概念，为将来从事食品、保健食品、药品领域工作奠定良好基础。上游发酵提取引入了一定规模的发酵罐培养实验，使实验更好地结合生产实际，不仅有助于进一步巩固学生微生物操作技能，还可促进学生建立制药工程概念；下游试验中采用了工业规模的制剂制备以及质量控制设备，使学生获得药物制剂的生产工艺和质量控制专业知识，为从事药品的开发与生产奠定基础。药理学评价实验要求学生熟练掌握动物实验技能以及数据分析能力，对培养学生综合实验技能和提高科研素养具有重要的意义。