黄滢洁,陈笑言,冯龙斐,梁新红,冉军舰,焦凌霞

（河南科技学院食品学院,河南新乡453003）

皇冠梨营养丰富,富含蛋白质、脂肪、维生素B、维生素C、苹果酸、膳食纤维等人体必需的物质,具有有润肺、止咳、清热、降火等功效[1].皇冠梨一般作为初级农产品直接销售,但因果实储藏、运输等产生了一系列成本,导致了皇冠梨的经济效益降低.皇冠梨不仅营养丰富,并且具有皮薄、果核小、可食率较高,肉嫩多汁的特点,比较适用于加工发酵果汁饮料[2].

乳酸菌是一类早期广泛用来发酵乳制品的益生菌,具有促进食物消化,提高人体免疫力,延缓人体衰老,维持肠道微生物生态平衡等功能[3-6].目前,乳制品益生菌已经以不同的形式进行商业化生产,但过敏和乳糖不耐受是影响乳制品益生菌的主要因素, 而风味和清爽性是果汁等非乳制品饮料的主要优点[7],因此,乳酸菌发酵果蔬汁是近年来最受关注的益生菌饮品[8-10].Chandrakant 等[11]应用嗜酸乳杆菌发酵梨汁时发现,发酵过程中α-葡萄糖苷酶的抑制活性显著上升,表明发酵梨汁具有抗高血糖的作用；Cagno 等[12]的研究表明乳酸发酵可以提高果汁的抗氧化性能和改善其感官特性.乳酸菌发酵对保护果蔬汁色泽、预防褐变有很好的效果,卢嘉懿等[13]应用植物乳杆菌发酵蜜梨,研究发现乳酸菌的发酵作用可有效降低梨汁褐变程度.乳酸菌发酵果蔬汁后活菌数较高,Liao[14]等利用内生肠膜明串珠菌发酵芒果汁,在4 ℃下放置30 d 后,活菌数达6.46×109cfu/mL.有关乳酸菌发酵果蔬汁的工艺亦有报道,崔莉等[15]利用植物乳杆菌和肠膜明串珠菌按1:2 混合后发酵黄秋葵汁,优化条件为发酵时间35 ℃、发酵时间72 h 和接种量5%,活菌数达108cfu/mL.刘磊等[16]采用驯化法将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌按1:1 混合接入龙眼汁中,由响应面优化法得到最优工艺条件为发酵时间12 h、发酵温度45 ℃、脱脂奶粉添加量5%、接种量3%.在该条件下,龙眼果浆的酸度由发酵前的9.5°T 升为105.1°T.

本试验以皇冠梨为主要原材料,应用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）协同发酵梨汁,探讨不同菌种比例、接种量、发酵时间、发酵温度对梨汁活菌数和感官评分的影响,在单因素的基础上进行响应面团的优化试验.旨在研制出一种具有较高活菌数和感官评分的发酵梨汁.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

皇冠梨,产于甘肃武威,采摘后储存于4 ℃冰箱中,大小较均一,颜色淡黄,无机械损伤.

L.plantarum 和L.acidophillus,购于中科院微生物保藏中心,保存于河南科技学院食品学院食品研究所.

1.2 仪器与设备

JYZ—E5V 型原汁机,九阳股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌器,上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；SW-CJ-1D 垂直净化工作台,苏州智净净化设备有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 梨汁的制备 挑选→清洗→去皮去核→切块→护色（将切块的梨用1 mol/L 的柠檬酸溶液浸泡护色）→榨汁→过滤（尼龙筛网200 目过滤,取澄清汁）→调酸（用NaHCO3将果汁pH 值调至4.0）→添加蔗糖→分装→灭菌（100 ℃水浴15 min）→冷藏待用.

制得的梨汁pH 值为4.0,糖含量的质量分数为24.7%.

1.3.2 乳酸菌菌种驯化 菌种驯化过程参考文献[17],根据具体试验略有改动,具体流程为：

菌种→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=9:1）→37 ℃培养24 h→第一次驯化菌种→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=8:2）→37 ℃培养 24 h→第二次驯化菌种→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=6:4）→37 ℃培养24 h→第三次驯化菌种→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=4:6）→37 ℃培养24 h→第四次驯化菌种→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=2:8）→37 ℃培养 24 h→第五次驯化菌种→牛奶梨汁混合物（V牛奶:V梨汁=1:9）→37 ℃培养24 h→驯化菌种→纯梨汁.

1.3.3 梨汁的发酵 将L.plantarum 和L.acidophillus 按要求分别或混合接种到梨汁中,在设定温度下静置发酵一定的时间,测定活菌数并进行感官评定.

1.3.4 发酵梨汁活菌数测定 活菌数按稀释涂布平板法计数[18].

1.3.5 单因素试验设计

1.3.5.1 菌种比例对发酵梨汁的影响 在一定的发酵温度、发酵时间和菌种接种量下,将L.plantarum 和L.acidophillus 按照体积比1:0、1:1、0:1 的菌种比例接入梨汁中,测定不同菌种比例对发酵梨汁活菌数和感官评分的影响.

1.3.5.2 发酵温度的确定 在一定的发酵时间和菌种接种量下,按照1.3.5.1 得出的最佳菌种比例,将L.plantarum 和 L.acidophillus 接入梨汁中,分别在 33、35、37、39、41 ℃下发酵,测定不同发酵时间对发酵梨汁活菌数和感官评分的影响.

1.3.5.3 发酵时间的确定 在一定的发酵温度和菌种接种量下,按照1.3.5.1 得出的最佳菌种比例,将L.plantarum 和 L.acidophillus 接入梨汁中,分别发酵 18、21、24、27、30 h,测定不同发酵时间对发酵梨汁活菌数和感官评分的影响.

1.3.5.4 菌种接种量的确定 在一定的发酵温度和发酵时间下,按照1.3.5.1 得出的最佳菌种比例,将L.plantarum 和L.acidophillus 接入梨汁中,在菌种接种量体积分数分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%下发酵,测定不同菌种接种量对发酵梨汁活菌数和感官评分的影响.

1.3.6 响应面优化试验设计 依据单因素试验结果,选取发酵温度、发酵时间、接种量3 个因素进行Box-Behnken 试验设计[19].

1.3.7 发酵梨汁感官评定 发酵梨汁感官评定由20 名专业的老师和同学组成,从颜色、香气、形态和口感4 个方面对各个梨汁样品进行品评分析,评定细则见表1[20].

表1 发酵梨汁的感官评分Tab.1 Sensory evaluation results of fermented pear juice

1.4 数据处理分析

每组试验重复3 次, 以平均值±标准偏差表示；单因素方差分析采用SPSS Satistics19.0 软件；Duncan 新复极差法进行显著性检验,以P<0.05 为显著性检验标准.

2 结果与分析

2.1 发酵梨汁的单因素试验

2.1.1 菌种比例对发酵梨汁的影响 不同菌种比例对发酵梨汁活菌数和感官评分的影响结果见图1.

图1 菌种比例对活菌数和感官评分的影响Fig.1 Effect of strain ratio on viable count and sensory evaluation

由图1 可知,梨汁的活菌数在L.plantarum 和L.acidophillus 体积比为1:1 时达到最大值,其值为（29.31±0.87）×108cfu/mL,显著高于单一菌株发酵（P＜0.05）.当菌种比例为1:1 时感官评分亦最高,其值为（84.5±2.8）分,表明混合菌株发酵梨汁效果良好,因此选择L.plantarum 和L.acidophillus 按体积比1:1 混合为最佳菌种.

2.1.2 发酵温度对发酵梨汁的影响 不同发酵温度对发酵梨汁的活菌数和感官评分的影响结果见图2.

图2 发酵温度对活菌数和感官评分的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on viable count and sensory evaluation

由图2 可知,当发酵温度在33～37 ℃时,随着温度的升高,发酵梨汁的活菌数显著增加（P＜0.05）.在37 ℃时活菌数达最高值,为（28.34±0.86）×108cfu/mL.随着温度继续增加,活菌数减少.在37 ℃时发酵梨汁感官评分最高,其值为85.0±3.5 分,随着温度继续升高,发酵梨汁感官评分降低,温度过高会破坏梨汁中的芳香物质,从而影响梨汁的口感和风味.因此37 ℃为最佳发酵温度.

2.1.3 发酵时间对发酵梨汁的影响 不同发酵时间对发酵梨汁的活菌数和感官评分的影响结果见图3.

图3 发酵时间对活菌数和感官评分的影响Fig.3 Effect of fermentation time on viable count and sensory evaluation

由图3 可知,当发酵时间在18～24 h 时,梨汁的活菌数显著增加,24 h 时活菌数达最大值为（28.53±0.06）×108cfu/mL；在24 h 和27 h 时,发酵梨汁的活菌数没有显著性差异（P＞0.05）；感官评分在 24 h 时达到最高值,为92.3±3.1 分,随着发酵时间的增加感官评分逐渐降低,表明发酵时间过长可能会影响发酵梨汁中风味物质,进而影响发酵梨汁的感官评分.因此最佳发酵时间为24 h.

2.1.4 接种量对发酵梨汁的影响 不同接种量对发酵梨汁的活菌数和感官评分的影响结果见图4.

图4 接种量对活菌数和感官评定的影响Fig.4 Effect of inoculum size on viable count and sensory evaluation

由图4 可知,接种量体积分数在1%～4%时,活菌数随着接种量的增加而上升,当接种量体积分数为4%时,发酵梨汁的活菌数最高,为（28.55±0.17）×108cfu/mL；随着接种量体积分数增加至6%,活菌数与4%时没有显著性差异（P＞0.05）.同时在接种量体积分数为1%～4%时,感官评分随接种量体积分数的增加而增加,4%时达到最大值为90.6±2.5 分.因此选择体积分数4%为最佳接种量.

2.2 响应面优化试验设计结果与分析

2.2.1 响应面试验结果和方差分析 基于单因素试验结果,按照L.plantarum 和L.acidophillus 体积比为1:1,选取接种量、发酵时间和发酵温度3 个因素,以发酵梨汁活菌数和感官评分为指标,通过Box-Behnken 设计响应面优化试验,试验因素水平见表2.

表2 Box-Behnken 试验设计因素水平Tab.2 Factors and level of response surface optimization in Box-Behnken design

表3 响应面试验结果Tab.3 Response surface test design and results

采用Design-Expert 8.0.5 软件进行多元回归拟合,得出活菌数（Y1）和感官评分（Y2）对接种量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）的二次多项回归方程为分别为

式（1）、式（2）中：Y1为活菌数,Y2为感官评分,A 为接种量,B 为发酵时间,C 为发酵温度.

活菌数的方差分析及显著性检验结果见表4.

表4 活菌数回归模型方差分析及显著性检验Tab.4 Analysis of variance and significance test of live bacterial count regression model

表5 感官评分回归模型方差分析及显著性检验Tab.5 Analysis of variance and significance test of sensory evaluation regression model

由表4 和表5 可知,两个回归方程模型极显著（P<0.000 1）,失拟项检验结果不显著.相关系数R2（活菌数）是0.989 2,R2（感官评分）是0.983 0,表明感官评分和活菌数的实测值和预测值之间拟合度较好,所以此模型拟合效果好,可用来分析预测乳酸菌发酵梨汁的工艺参数.响应值为活菌数和感官评分的模型回归方程系数显著性试验均表明,一次项A 不显著,B、C 是极显著；交互项AB、BC 极显著,AC 不显著；二次项A2、B2、C2影响都极显著.各因素对活菌数和感官评分的影响均为B（发酵时间）＞C（发酵温度）＞A（接种量）.

2.2.2 响应面分析 各因素交互作用对发酵梨汁活菌数的影响结果见图5.

图5 各因素交互作用对发酵梨汁活菌数的影响Fig.5 Effect of interaction of various factors on the viable count of fermented pear juice

由图5-a 可知,当接种量一定时,发酵温度和发酵时间的交互作用极显著.在发酵温度一定时,随着发酵时间的增加,活菌数先增加后减少；在发酵时间一定时,活菌数随着温度的升高逐渐增加后减少.由图5-b 可知,当发酵温度一定时,发酵时间和接种量的交互作用极显著.在发酵时间一定时,活菌数随着接种量的增加而显著增加,后趋于平缓；在接种量一定时,活菌数随着发酵时间的增加而显著增加.

各因素交互作用对梨汁感官评分的影响结果见图6.

图6 各因素交互作用对梨汁感官评分的影响Fig.6 Effect of interaction of various factors on sensory evaluation of pear juice

由图6-a 可知,当接种量一定时,发酵温度和发酵时间的交互作用极显著.在发酵温度一定时,随着发酵时间的增加,感官评分先增加后减少；在发酵时间一定时,感官评分随着温度的升高逐渐增加后减少.由图6-b 可知,当发酵温度一定时,发酵时间和接种量的交互作用极显著.在发酵时间一定时,随着接种量的增加,感官评分先显著增加后趋于平缓；在接种量一定时,感官评分随着发酵时间的增加而显著增加,后趋于平缓.

2.2.3 最佳条件的预测和验证 通过回归模型的预测得到发酵梨汁的最佳工艺为菌种接种量体积分数3.71%、发酵时间25.20 h、发酵温度37.63 ℃.此时发酵梨汁的感官评分的预测值90.14±0.92 分,活菌数为（29.83±0.68）×108cfu/mL.综合考虑,把最优条件修正为菌种接种量体积分数4%、发酵时间25h、发酵温度37 ℃.在此条件下进行3 次平行试验进行验证,得到发酵梨汁的活菌数为（29.53±0.68）×108cfu/mL,感官评分93.2±2.9 分.和预测值相比,活菌数和感官评分的误差值分别是和1.10%和3.08%,说明采用响应面进行优化得出发酵梨汁的最佳工艺条件较可靠,验证了该模型的有效性.

3 小结

利用乳酸菌发酵皇冠梨汁,菌种采用L.plantarum 和L acidophillus 按体积比为1:1 进行混合发酵.通过响应面方法对发酵参数优化,最佳发酵工艺参数为发酵温度37 ℃、发酵时间25 h、接种量体积分数4%,在此条件下活菌数可达（29.53±0.68）×108cfu/mL,感官评分可达93.2±2.9 分.试验获得了具有较高活菌数和风味良好的发酵梨汁,为实现乳酸菌发酵梨汁的工艺优化提供了理论和现实依据.