李寻,梅帅,张宇乐,程艺凡,吴梦莉,王菲,黄文文

（河南科技学院资源与环境学院,河南新乡453003）

土壤是微生物的生活场所,土壤微生物多样性受土壤理化性质以及类型等各种因素的影响,同时微生物也影响着土壤生态系统结构和功能的变化,在土壤养分转化过程中与腐殖质形成过程中占有重要的位置,也是维护土壤生产力的重要组分[1].土壤微生物多样性又叫土壤微生物群落结构,包括生理功能多样性、细胞组成多样性和遗传物质多样性等,它是最有潜力的敏感性生物指标之一.通过生物多样性的变化可预测土壤养分和环境质量的变化过程,并呈现微生物的生态功能差异[2].土壤的微小变化可以通过微生物多样性动态变化表现出来,所以在未能掌握准确测定土壤有机质变化的技术时,微生物多样性的动态变化是土壤微妙变化的有力证明.此外,微生物占据了土壤生物体中近乎一半的碳和绝大部分的氮、磷,而且微生物的代谢是大部分生态过程不可或缺的环节,因此,微生物在生态系统物质循环和能量流动过程起着重要作用[3].

磷是重要的养分元素,参与植物体内许多生物化学反应过程[4],土壤中的磷是植物利用磷素的主要来源,而磷肥的施入又保障了土壤中磷的含量[5]在土壤可利用磷含量较低的情况下,植物通过自身释放很多的酸性磷酸酶、有机酸等根系分泌物使土壤中难溶性的磷活化然后进行利用,同时也改善了土壤中微生物的活性甚至是微生物的多样性[6].但并不是所有土壤条件下的氮磷添加都能增加土壤的生物多样性[7-10],二者的施用因研究区域、种植方式、试验操作时长等因素的不同,造成国内外关于氮磷添加对土壤微生物多样性影响的研究结果存在着较大差异,如张瑞等[11]发现施肥可以提高土壤微生物的代谢活性和微生物功能多样性.Sarathchandra 等[12]研究了草地土壤微生物对氮、磷肥添加的响应,了解到持续10 a的氮添加降低了土壤微生物功能多样性,但是磷添加则对土壤微生物功能群无明显影响.

呼伦贝尔草原地上和地下部分的研究一直都是热点,但大多研究侧重探讨人为干扰和季节变化对土壤微生物的影响,而非生物成分与土壤微生物的关系则鲜被关注,如文都日乐等[1]研究了不同放牧程度对呼伦贝尔草原土壤微生物的影响,结果表明微生物的数量随着放牧强度的增加而不断减少；李梓正等[13]研究的结果表明随着不同退化程度、不同季节土壤细菌群落结构的变化,变形菌门（Proteobacteria）逐渐成为呼伦贝尔草原土壤中的优势细菌种类.本试验探究了不同磷添加处理条件下呼伦贝尔草原土壤微生物群落结构和功能的变化,以期为保护草原植物栽培技术提供理论参考,为营造良好的草原微生态环境提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 研究区概况

呼伦贝尔草原地处北纬 47°20′～50°51′,东经 115°31′～121°35′,总面积为 76 277 km2,平均海拔在650～700 m 之间[1],其气候主要表现为温带大陆性气候,夏季温度适宜,但多降水,冬季严寒,春秋两季存在着恶劣天气.日照时间在年平均2 900 h 左右；年均降水量在325 mm；风速一般在4 m/s 以上[14].呼伦贝尔草原地带性土壤有黑土、暗棕壤、棕色针叶林土、灰色森林土、黑钙土和栗钙土；隐域性土壤主要有草甸土、沼泽土、风沙土、盐土和碱土等[15].

1.2 试验设计

试验设置在贝加尔草原上一个于2006 年禁牧的围封草场中,共4 个磷添加梯度：对照（Control,0 g/（m2a））、处理一（P2,2 g/（m2a））、处理二（P6,6 g/（m2a））和处理三（P10,10 g/（m2a））.每个处理进行5 次重复,共计20 个样方,每个样方的面积为7 m×7 m,为避免样方之间的相互影响,每个样方之间的距离设置为2 m.磷素（含磷20%的过磷酸钙）于当年6 月初施入,样品采集时间是8 月中旬.采集方法是土钻法,用直径为5 cm 的土钻在样方中随机选取3 个点采集0-15 cm 的土并混合均匀,然后对土样进行过筛处理,一部分常温风干用于测量土壤理化性质,另一部分低温（-70 ℃）保存,两个月内用于土壤微生物群落结构的分析.

1.3 测定项目及方法

土壤含水量使用Stevens 公司生产的POGO 便携式土壤水分传感器测定[16].土壤pH 是将土样按m水:m土=5:1 加入无CO2的蒸馏水浸提30 min,用PHS-3C 酸度计测定上清液pH 值.土壤碳的测定是利用重铬酸钾容量法,即在加热状态下,用重铬酸钾-硫酸溶液将土壤中的有机碳氧化,然后过量的重铬酸钾用硫酸亚铁进行滴定（指示剂为邻菲罗啉）,根据消耗的重铬酸钾量计算测定土壤碳的含量[17].土壤全氮的测定采用Foss 公司生产的凯氏定氮仪,利用重铬酸钾-硫酸消化法测定,即将试验土样与浓硫酸及还原性催化剂共同加热消化,使土壤中有机氮转化成氨,进而形成硫酸铵（有机质被氧化成CO2,极微量的硝态氮也在加热过程中逸出）,再用浓碱蒸馏,硼酸吸收,然后用标准盐酸进行滴定[18].土壤全磷主要采用硫酸-高氯酸消煮法.土壤中的磷素在高温下与浓硫酸和强氧化剂高氯酸作用,转化为正磷酸盐进入溶液后,用钼锑抗比色法即可测得[18].土壤磷脂脂肪酸含量测定,根据Bossio 等使用的Phosphor Lipid Fatty Acid（PLFA）方法[19]综合现有文献,将检测到的脂肪酸标记物划分为细菌、真菌、放线菌、菌根真菌（AMF）、腐生真菌（SF）、革兰氏阴性菌（G-）和革兰氏阳性菌（G+）[20-22].各种微生物功能群的脂肪酸标记物如表1 所示.

表1 特征微生物的脂肪酸Tab..1 Fatty acids of characteristic microbe

1.4 数据处理

所有试验数据采用SPSS 软件进行单因素方差分析（ANOVA）和LSD 多重比较,显著水平为5%；作图采用Sigmaplot 软件.

2 结果与分析

2.1 对土壤理化性质的影响

磷添加对土壤理化性状的影响结果见表2.

表2 磷添加对土壤理化性状的影响Tab.2 Effects of phosphorus addition on soil physical and chemical properties

由表2 可知,随着磷添加量的增加,土壤pH 呈降低趋势,当磷添加量大于6 g/（m2a）时,土壤pH 值不再下降,维持在7.18 的水平.土壤含水量在磷添加量为2 g/（m2a）时,达到最大值,为15.6%.土壤全碳则在磷添加量为6 g/（m2a）时,含量最高,为26.19 g/kg.当磷添加量在10 g/（m2a）时,土壤全氮的含量最高,为2.21 g/kg.随着磷添加量的增加,土壤全磷的变化呈缓慢上升的趋势,当磷添加量在6 g/（m2a）时,土壤全磷含量上升到0.86 g/kg,而磷添加量为10 g/（m2a）时,土壤全磷的量不再增加.单因素方差分析表明,磷添加处理并没有显著地改变土壤pH 值、土壤含水量、土壤全碳和土壤全氮（P>0.05）.与对照相比,低磷添加处理（2 g/（m2a））对土壤全磷无显著影响（P>0.05）,但磷添加为6～10 g/（m2a）时则显著地影响了土壤全磷的变化,使土壤全磷含量增加了19.44%（P<0.05）.

2.2 对土壤微生物的影响

2.2.1 对土壤PLFAs 和细菌PLFAs 的影响 磷添加对土壤PLFAs 和细菌PLFAs 的影响结果见图1.

图1 磷添加处理对土壤PLFAs 和细菌PLFAs 的影响Fig.1 Responses of the total PLFAs and bacterial PLFAs to phosphorus addition

由图1 可知,土壤PLFAs 和细菌PLFAs 在磷添加处理下表现出相同的变化趋势,即低磷添加（2g/（m2a））处理会降低二者的含量,中等程度的磷添加（6 g/（m2a））处理会增加二者的含量,高磷添加（10 g/（m2a））处理下,土壤PLFAs 和细菌PLFAs 的变化不大.单因素方差分析表明,与对照相比,磷添加处理对土壤PLFAs 无显著影响（P>0.05）,中等程度磷添加处理与低磷添加处理下的土壤PLFAs 差异显著（P<0.05）,前者比后者高29.57% ,但高磷添加和低磷添加及中等程度的磷添加处理下的土壤PLFAs 差异不显著（P>0.05）（图1-A）.低磷添加量（2 g/（m2a））下的细菌PLFAs 比对照低23.61%,低磷添加处理下的细菌PLFAs 比中等程度磷添加处理低30.47%（P<0.05）,高磷添加处理下的细菌PLFAs 和对照相比差异不显著（P>0.05）（图1-B）.

2.2.2 对革兰氏阳性菌和阴性菌的影响 磷添加对革兰氏阳性菌和阴性菌的影响结果见图2.

图2 磷添加处理对革兰氏阳性菌和阴性菌的影响Fig.2 Responses of the gram-positive and negative bacterial PLFAs to phosphorus addition

由图2 可知,革兰氏阳性菌和阴性菌的含量在不同磷添加处理下的变化趋势一致.即低磷添加（2g/（m2a））处理会降低二者的含量,中等程度的磷添加（6 g/（m2a））处理会增加二者的含量,高磷添加（10 g/（m2a））处理下,土壤中革兰氏阳性菌和阴性菌含量的变化不大.单因素方差分析表明,与对照相比,磷添加处理对土壤革兰氏阳性菌和阴性菌均无显著影响（P>0.05）,但中等程度磷添加处理与低磷添加处理下的革兰氏阳性菌及阴性菌差异显著（P<0.05）,前者比后者分别高29.63%和31.36%,但高磷添加和低磷添加及中等程度的磷添加处理下的土壤革兰氏阳性菌及阴性菌差异皆不显著（P>0.05）.

2.2.3 土壤微生物与土壤理化性质的相关性 土壤微生物与土壤理化性质的相关性分析结果见图3.

图3 土壤微生物与土壤理化性质的相关性Fig.3 The relationships of soil PLFAsandsoilphysicalandchemicalproperties

由图3 可知,土壤PLFAs 和革兰氏阳性菌与土壤理化性质无显著相关性,而细菌PLFAs 和革兰氏阴性菌皆与土壤全碳有显著正相关关系（P<0.05）,但二者与其他土壤理化指标无显著相关性（P>0.05）.

3 结论与讨论

本研究表明,磷添加对土壤全磷具显著影响,而对土壤pH 值、土壤含水量、土壤全氮和土壤全碳均无显著影响.这可能因为土壤理化性质更多的是和立地类型、土层深度、季节动态以及植物的物候期有显著相关性[23],而本研究的试验时间相对较短,无法明确体现出季节变化,且研究时间在6—8 月,地上部分植物的物候期亦无明显变化,因此,磷添加对土壤pH 值、土壤含水量、土壤全氮和土壤全磷等理化性质的影响不显著.Wang 等[24]在钙质草原上进行磷添加,结果发现土壤全磷和磷添加呈显著正相关,这和本研究的结果也是一致的.

磷添加对土壤中磷脂脂肪酸总量、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和细菌无显著影响,且均在P6 的添加量下出现微生物功能群浓度的最大值,在P10 的添加量下出现了低于P6 的微生物功能群浓度.而在对土壤理化性质与微生物功能群之间进行相关性分析发现：土壤全磷与微生物功能群之间没有较明显的相关性,即磷添加与土壤微生物功能群浓度之间没有较明显的相关性,而土壤全碳与革兰氏阳性菌和细菌有较明显的正相关性.齐莎等[7]发现土壤微生物利用碳源的能力因为连续5 a 氮磷肥施用而明显降低,而且连续施肥之后微生物功能多样性随着磷肥用量的增加而降低,尤其是当施磷量达到7.5 g/（m2a）时,降低最为明显,但土壤微生物量则随着施磷量的增加而提高.在赵晓琛等[8]的中,氮磷养分添加方式可以增强土壤微生物代谢活性、物种丰富度指数和微生物群落碳源利用能力.本研究的结果说明,在低磷含量下,磷添加对于提高微生物量具有促进作用.但是在高磷使用量的状态下并不利于微生物量的进一步提高,反而会使微生物的量降低,从而也会影响到植物根系对土壤中营养元素的吸收,影响到植物的生长发育,因此磷的施用应当合理适度,较高的磷施用量不仅易造成养分浪费和水污染,而且还会降低肥料的利用率,甚至可能还会抑制植物自身的生长发育.