罗特丹，姜昕，周冲冲，李鹏

（深圳市人民医院 老年病科，广东 深圳 518020）

随着中国老龄化程度的加速，冠状动脉粥样硬化性心脏病（以下简称冠心病）的患病率及病死率逐年增加。经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention, PCI）通过开通狭窄冠状动脉能明显降低冠心病患者的病死率，改善预后，因此在临床中得到广泛的应用，但发生术后再狭窄仍然是影响PCI 疗效的重要原因。有研究表明，PCI 造成损伤血管局部炎症反应是术后再狭窄的根本原因，而Th17 和Treg 细胞免疫失衡引起的炎症失控在多种疾病中扮演着重要角色，但是否在再狭窄的发生、发展中发挥作用尚无相关报道[1-3]。白芍总苷作为临床中被广泛应用的非特异性抗炎药能否通过调节Th17 和Treg 细胞的凋亡，发挥抑制PCI 术后再狭窄的作用亦无相关研究。如今药物涂层球囊在PCI 中占据一席之地，有研究显示，药物球囊与第二代洗脱支架相比在治疗再狭窄方面无明显区别[4]。

本实验旨在通过复制大鼠颈动脉球囊损伤模型，应用药物浸泡球囊方法模拟药物涂层球囊，研究白芍总苷干预前后Th17、Treg 细胞数量及内膜的变化，为治疗再狭窄寻找新方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

SPF 级14 ～16月龄雄性SD 大 鼠[SCXK（粤）2019-0035]36 只由广东省医学实验动物中心提供。Th17 和Treg 细胞检测试剂盒购自美国eBioscience 公司，白芍总苷购自宁波立华制药有限公司（批号： H20055058）。

1.2 方法

1.2.1 复制大鼠颈动脉球囊损伤模型36 只大鼠被随机、等量分成对照组、球囊损伤组、白芍总苷浸泡球囊组及白芍总苷灌胃组，每组9 只。各组大鼠模型复制前4 d 用生理盐水灌胃，20 ml/d，白芍总苷灌胃组用200 mg/（kg·d）白芍总苷生理盐水灌胃，20 ml/d。各组大鼠模型复制前12 h 皮下注射低分子肝素，球囊浸泡组的球囊浸泡于5 g/L 白芍总苷生理盐水4 h。各组术前麻醉后，在左颈总动脉靠心脏一端阻断血流，切开颈外动脉。对照组做假手术，只结扎颈外动脉再缝合切口。其余组复制球囊损伤模型： 用规格2.0 mm×10.0 mm 的Medtronic 球囊导管从切口处插入至颈总动脉约1.5 cm，用200 kPa 压力充盈球囊，向远离心脏一端拖拉导管，剥脱动脉内膜，抽除气体后，再送向近心脏一端，如此重复3 次，移去导管，结扎切口，去掉颈总动脉血管夹，恢复阻断血流，缝合伤口。术后24 h 再次皮下注射低分子肝素预防血栓。术后肌内注射青霉素3 d 预防感染。术后白芍总苷灌胃组用200 mg/（kg·d）白芍总苷生理盐水灌胃，20 ml/d，共13 d，其余组用生理盐水灌胃，20 ml/d，共13 d。模型复制过程中由于损伤严重死亡5 只，标本取材时因发现血栓导致颈总动脉栓塞而剔除1只。最终纳入实验共30只，对照组、球囊损伤组、白芍总苷灌胃组及白芍总苷浸泡球囊组分别为9、6、7 和8 只。

1.2.2 指标检测①标本取样： 术后14 d，在麻醉下取各组大鼠左颈总动脉球囊损伤部位，长度约1.5 cm，以2 根血管作为1 个样本。取0.5 cm 长的损伤血管置于4%多聚甲醛中固定，制成石蜡标本。每个标本按距心脏近、中及远端连续切4μm 厚的切片10 张，苏木精-伊红染色后，用显微镜观察动脉管腔变化。取大鼠脾脏用于流式细胞仪分析。②病理学检测血管内膜变化： 应用Quantiment 520 型计算机图像分析仪分别测量各组血管的管腔、内膜及中膜横断面面积[5]。③流式细胞仪检测Th17、Treg 细胞分别占CD4+T 细胞的百分比： 无菌分离大鼠脾脏，使用无菌注射器活塞部分研磨脾脏，细胞过滤器上过滤，离心后去上清，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至2×107个/ml，将100μl 细胞悬液加入流式管中，标记细胞外标荧光抗体（CD3 PE-Cy5、CD4-FITC 及CD25 PE-CY5.5），混匀后4℃避光孵育30 min，加染色缓冲液2 ml 后离心洗涤2 次，弃上清液，加入固定穿膜液1 ml 后4℃避光孵育30 min 进行穿膜。加入穿膜缓冲液2 ml 离心洗涤2 次后弃上清，加入流式内标荧光抗体（PE标记的Foxp3，APC-CY7 标记的IL-17A）4℃避光孵育30 min，用穿膜缓冲液洗2 ml 离心洗涤2 遍后弃上清，加入染色缓冲液，流式细胞仪检测并分析Th17（CD3+CD4+IL-17A+）及Treg（CD4+CD25+Foxp3+）的比例，应用Flowjo 7.6.1 软件分析数据。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步的两两比较用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组主动脉内膜增生程度比较

各组管腔面积、内膜面积及内膜面积/中膜面积比值比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组内膜光滑无增厚，仅由一层扁平的血管内皮细胞组成；球囊损伤组新生内膜形成导致内膜增厚，新生内膜主要由大量增殖的血管平滑肌（vascular smooth muscle, VSM）细胞构成，增生的VSM 细胞排列无序紊乱，管腔面积较对照组小，内膜面积及内膜面积/中膜面积比值较对照组大（P＜0.05）；白芍总苷灌胃组新生内膜较球囊损伤组薄，管腔狭窄程度较球囊损伤组明显减轻，管腔面积较球囊损伤组大，内膜面积及内膜面积/中膜面积比值较球囊损伤组小，但高于对照组（P＜0.05）。白芍总苷浸泡球囊组内膜较白芍总苷灌胃组薄，增生的VSM 细胞较白芍总苷灌胃组少，管腔面积较白芍总苷灌胃组大，内膜面积及内膜面积/中膜面积比值较白芍总苷灌胃组小，但高于对照组（P＜0.05）。见表1和图1。

表1 各组主动脉内膜增生程度比较 （±s）

表1 各组主动脉内膜增生程度比较 （±s）

注： ①与对照组比较，P ＜0.05；②与球囊损伤组比较，P ＜0.05。

组别 n 管腔面积/mm2 内膜面积/mm2 中膜面积/mm2 内膜面积/中膜面积对照组 9 0.846±0.012 0.033±0.028 0.343±0.013 0.085±0.011球囊损伤组 6 0.472±0.016① 0.481±0.017① 0.331±0.013① 1.436±0.048①白芍总苷灌胃组 7 0.634±0.014①② 0.254±0.015①② 0.343±0.021①② 0.753±0.014①②白芍总苷浸泡球囊组 8 0.735±0.016①② 0.188±0.012①② 0.363±0.015①② 0.543±0.033①②F 值 5.741 4.853 1.165 4.519 P 值 0.008 0.017 0.133 0.022

图1 各组颈动脉球囊损伤后的病理切片 （HE 染色×400）

2.2 各组Th17、Treg 占CD4+T 细胞的百分比及Th17/Treg 比较

各组Th17、Treg 占CD4+T 细胞的百分比及Th17/Treg 比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。球囊损伤组Th17 占CD4+T 细胞的百分比、Th17/Treg 高于白芍总苷灌胃组、白芍总苷浸泡球囊组及对照组（P＜0.05）；且白芍总苷浸泡球囊组低于白芍总苷灌胃组，而高于对照组（P＜0.05）。白芍总苷灌胃组Treg 占CD4+T 细胞的百分比高于球囊损伤组及对照组（P＜0.05），且白芍总苷浸泡球囊组高于白芍总苷灌胃组（P＜0.05）。见表2和图2、3。

表2 各组Th17、Treg 占CD4+T 细胞的百分比及Th17/Treg 比较 （%，±s）

表2 各组Th17、Treg 占CD4+T 细胞的百分比及Th17/Treg 比较 （%，±s）

注： ①与对照组比较，P ＜0.05；②与球囊损伤组比较，P ＜0.05；③与白芍总苷灌胃组比较，P ＜0.05。

组别 n Th17 占CD4+ T 细胞百分比 Treg 占CD4+ T 细胞百分比 Th17/Treg对照组 9 0.27±0.05 0.33±0.06 0.79±0.10球囊损伤组 6 1.24±0.07① 0.52±0.07① 2.52±0.12①白芍总苷灌胃组 7 1.02±0.06①② 0.88±0.08①② 1.28±0.08①②白芍总苷浸泡球囊组 8 0.87±0.06①②③ 1.05±0.08①②③ 0.91±0.11①②③F 值 5.274 4.526 4.381 P 值 0.018 0.023 0.026

图2 各组大鼠脾脏中Th17 细胞比例

图3 各组大鼠脾脏中Treg 细胞比例

3 讨论

PCI 术后血管再狭窄的过程实质上是血管对损伤所致炎症反应的修复过程，PCI 所致局部内皮细胞损伤及功能障碍诱发的炎症反应释放多种炎症细胞因子，促进VSM 细胞分化、增生并向损伤部位移行，使血管重建最终导致再狭窄，因此可以认为炎症是再狭窄的始发因素[6]。

有研究显示，各种导致动脉粥样硬化的危险因素均可引起血管内Th17 细胞的增加，由Th17 细胞分泌的IL-17A 能介导白细胞黏附于血管内皮之上，最终促进炎症的发展[7-9]。有研究发现球囊损伤能通过激活核转录因子-κB（NF-κB）途径引起IL-17A 的大量分泌，并作用于VSM 细胞，致使球囊损伤后局部管腔狭窄，间接表明Th17 细胞增多在再狭窄中占有重要的地位[5]。笔者发现球囊损伤后损伤血管内膜面积与Th17 细胞比例相关，表明球囊损伤可使Th17 细胞数量增加并促进VSM 细胞向损伤部位的迁移及增殖，最终引起管腔狭窄。其机制可能是局部损伤所致Th17 细胞大量激活，Th17 通过NF-κB 途径引起IL-17A、IL-6 等促炎因子的分泌，产生局部炎症瀑布，使炎症进一步扩大，最终导致血管内膜增厚。

Treg 细胞是一类对慢性炎症疾病具有重要保护作用的T 细胞亚群，能通过分泌如IL-10 等抑制炎症的细胞因子及抑制效应T 细胞的增殖，达到抑制炎症的效果[10]。Treg 细胞可通过抗巨噬细胞和血管内皮细胞炎症活性而抑制动脉粥样硬化的发展[11]。多项临床试验表明，动脉粥样硬化性疾病与各种信号通路介导的细胞凋亡途径引起Th17/Treg 细胞失衡相关[12-13]。而Th17/Treg 失衡，将导致免疫失衡，并引起一系列炎症反应。笔者发现球囊损伤后Treg 细胞比例较对照组明显增加，且Treg 细胞比例与球囊损伤后管腔面积相关，考虑球囊损伤引起局部炎症，机体通过上调Treg 细胞比例抑制IL-6 等炎症因子进一步产生，并促进IL-10 等抑炎因子的分泌，避免球囊损伤造成的炎症反应的级联扩大而抑制再狭窄。并且随着炎症的扩大，通过负反馈机制使Treg 细胞激活增多，但由于Treg 细胞增多所产生的抑炎效果不足以完全抵消由于Th17 细胞增多所带来的促炎效果，最终球囊损伤引起的局部炎症反应所致再狭窄仍不可避免发生，这从球囊损伤后Th17 细胞的变化幅度较Treg 细胞变化幅度大中得以证实。因此纠正球囊损伤后Th17/Treg 细胞失衡在阻止再狭窄的发生中具有重要意义。

白芍总苷是从中药白芍中提取出的有效成份，是目前临床广泛应用的一种免疫调节剂。有研究报道白芍总苷能通过抑制NF-κB 等通路减少Th17 细胞分化，最终减轻炎症导致的临床症状[14]。LIN 等[15]研究发现，白芍总苷能通过降低Foxp3基因启动子区域甲基化水平及脱甲基作用，促进Foxp3 的表达，提高Treg 占CD4+T 细胞的百分比。有实验发现，白芍总苷能通过调节Th17/Treg 细胞平衡达到治疗炎症性疾病的目的[16-17]。本研究中无论是应用灌胃的方法使白芍总苷作用于全身，还是应用球囊浸泡的方法使白芍总苷作用于局部，在降低球囊损伤后脾脏Th17 细胞水平的同时还能提高Treg 细胞水平，使Th17/Treg 降低，且Th17/Treg 与狭窄程度及VSM 细胞增生程度相关。提示白芍总苷能通过上述信号途径负向调节球囊损伤后大鼠Th17/Treg 细胞平衡，发挥抗炎和免疫调节的作用，达到抑制再狭窄的目的。本研究中白芍总苷上调Treg 细胞的能力较下调Th17 细胞明显，可能是白芍总苷先通过上调Treg 细胞至一定程度后，再通过Th17/Treg 免疫系统负向调节Th17 细胞的分化。而且还发现，应用白芍总苷浸泡球囊的方法，同样能调节Th17/Treg 细胞免疫失衡，以达到抑制球囊损伤后再狭窄的目的，且效果好于白芍总苷灌胃。结果提示可将白芍总苷作为药物球囊涂层局部使用，其较全身使用能更好地抑制球囊损伤后的再狭窄，且无明显不良反应。考虑其原因为局部使用白芍总苷较全身使用时损伤部位白芍总苷浓度更高，故能更好地调节Th17/Treg 细胞免疫失衡而抑制炎症。但无论应用何种方法干预，对照组管腔面积最大，考虑白芍总苷虽然能通过调节Th17/Treg 细胞免疫失衡减少炎症的进一步扩大，但并不能完全消除炎症引起的VSM 细胞增生。

目前已经进入药物洗脱支架时代，但因支架的金属网格残留特点仍可导致再狭窄的发生。且在多项研究中药物洗脱支架仍有争论，一项关于现阶段使用的药物洗脱支架安全性的荟萃分析发现，对比金属裸支架，药物洗脱支架有更多的晚期血栓风险[18]。因此无论从临床上还是社会经济学方面考虑都迫切需要寻找一种新的药物，以减少再狭窄的发生。白芍总苷或可作为球囊的药物涂层应用于PCI 术中，通过调节Th17/Treg 细胞免疫失衡，抑制炎症介导的VSM 细胞的增殖及向损伤部位的迁移，减少支架内内膜增生，达到减少再狭窄发生的目的，因此期待通过大规模临床试验来验证白芍总苷作为药物球囊的涂层，减少PCI 术后再狭窄的发生。