叶 枫，汤宏赤，张剑堡，和竹新，和正鹏，范锐鸿，林丽华，郭 媛，刘江丽，庞 浩,,*

（1.广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁 530004；2.广西科学院 国家非粮生物质能源工程技术研究中心，非粮生物质酶解国家重点实验室，广西生物炼制重点实验室，广西 南宁 530007；3.丽江大然生物有限公司，云南 丽江 674100）

低聚糖是低分子质量的碳水化合物，又称寡糖，一般是由10 个以内的单糖以糖苷键连接成直链或支链的聚合物，介于单糖与多糖之间，按照生理特性又可分为普通低聚糖和功能性低聚糖[1-2]。国内外研究中，一些功能性低聚糖在促进益生菌生长、增强免疫、改善肠道疾病等方面有突出作用[3-5]，这些功能性低聚糖被归类为益生元。Gibson等[6-7]在1995年首次提出益生元的概念并在2004年对其定义进行更新，益生元指一些不被宿主消化吸收，却能够选择性地促进体内有益菌的代谢和增殖，从而改善宿主健康的有机物。

近年来，益生元在医药、饲料、食品等领域的应用成为国内外的研究热点。在医药领域，益生元对于治疗胃肠道疾病和过敏反应具有突出作用[8-9]。在饲料中添加益生元，能够有效促进动物肠道有益菌的增殖、提高内源消化酶活性、保护动物肝脏、调节脂类代谢以及降低胆固醇和血脂等[10-11]，Markowiak等[12]报道将益生元应用于动物养殖中，能够提高动物免疫状况以及改善肉类、牛奶和鸡蛋的品质。益生元在食品领域中的应用最为广泛，可应用于面包、饼干、婴儿奶粉、发酵牛奶和乳制品等产品中[13-14]。Alizadeh等[15]研究表明在婴儿奶粉配方中添加了低聚半乳糖，通过刺激机体免疫，增加唾液和结肠中免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）的分泌量，同时促进肠道菌群生长以及调节肠道平衡；Longoria-García等[16]将益生元作为反式脂肪的替代物应用于烘焙食品中，避免反式脂肪的不良影响，使产品质构和口感良好且具有健康肠道的功能作用。

低聚糖作为功能成分添加到药物、饲料、食品等中，其热力学稳定性和分解特性成为药物、食品等加工工艺设计的一个关注点[17-18]。目前，国内外研究学者对于低聚糖类化合物的相关研究主要集中在对糖的分离纯化、结构解析、合成和生物活性功能等方面[19-20]，对于低聚糖的热分解和热稳定性研究较少。特别是对于新型的益生元，如魔芋葡甘露低聚糖等缺乏相关热稳定性的分析数据。来自魔芋的葡甘露低聚糖是一种新型的益生元，是由D-甘露糖以β-1,4-糖苷键连接形成主链以及主链或支链上以β-1,3-糖苷键连接葡萄糖而成的水溶性多糖，主要由魔芋块茎中葡甘聚糖降解得到，已成为国内外市场上新型的益生元[21-22]。为探究葡甘露低聚糖和低聚果糖热稳定性的影响，本实验以这两种益生元为材料，采用Kissinger、Kissinger-Akahira-Sunose（KAS）和Flynn-Wall-Ozawa（FWO）3 种动力学分析方法对两种益生元热解后的稳定性进行分析，以便于后续研究工作中深入分析低聚糖化合物的结构和性质，同时也为葡甘露低聚糖和低聚果糖在药物和食品工业领域进行配方设计和加工工艺设计提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡甘露低聚糖（聚合度2～6，纯度99%） 丽江大然生物有限公司；低聚果糖（聚合度2～5，纯度99%）山东保龄宝生物股份有限公司；葡萄糖（分析纯）国药集团化学试剂（上海）有限公司；D-果糖、D-甘露糖（纯度99%） 上海源叶生物科技有限公司；乙腈赛默飞世尔（上海）科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TGA Q50热重分析仪 美国TA仪器公司；高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）系统 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低聚糖含量HPLC分析

1.3.1.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为体积分数80%乙腈，流动速率为1 mL/min，柱温为25 ℃，进样量20 μL。

1.3.1.2 HPLC分析

分别以超纯水为溶剂配制质量分数为2%的葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖溶液，用超纯水配制质量分数40%葡甘露低聚糖溶液和10%低聚果糖溶液，所有试剂通过0.22 μm的滤膜过滤，用单糖进行标样，定量分析多糖中单糖的质量分数，每个样品做两次平行。

1.3.2 低聚糖热稳定性测定

对TGA Q50进行温度和质量校准。所有样品在实验之前进行烘干处理，称取适量（不高于11 mg）样品放入带有吊篮的Al2O3坩埚中。温度30～600 ℃，升温速率为5、10、15、20 ℃/min，使用高纯氮气作为保护气，气流速率为50 mL/min，每个样品做两次平行。

1.3.3 低聚糖热分解动力学分析

固体一步热解过程可以表示为：低分子聚糖→碳+挥发性气体。从低分子聚糖到挥发性气体的热力学参数依据Arrhenius定律按公式（1）[23]计算。通常无模式函数法采用非等温线性升温速率β，按公式（2）计算。由公式（1）、（2）得到公式（3）。

式 中：α为 转 化 率；A为 指 前 因 子/s-1；β为 升温速率；E为活化能/（k J/m o l）；R为气体常数8.314 J/（K·mol）；T为温度/℃；t为时间/min。

转化率α又可以按公式（4）表示。

式中：m0为样品初始质量/g；mt为任意t时刻样品质量/g；mf为样品最终质量/g。

采用非等温无模式函数法[23-24]，分别用Kissinger法、KAS法和FWO法对葡甘露低聚糖和低聚果糖热解过程进行非等温动力学分析。分别按公式（6）、（7）、（8）计算。

式中：Tm为微商热重（ differential thermogravimetry，DTG）曲线峰温；Ek、Ea和Eo分别为对应分析方法所得的活化能。

在Kissinger法中，由于非等温过程改变加热速率，DTG曲线峰温随之改变，以ln（β/Tm2）对1/Tm作图进行拟合性分析，得到直线斜率后对应-Ek/R可以计算出活化能Ek，由截距可求得指前因子A；在KAS法中，由于-与β/T2无直接联系，而Ea是等转化率α所对应的表观活化能，以ln（β/T2）对1/T作图进行拟合性分析，得到直线斜率后对应-Ea/R可以计算出活化能Ea；在FWO方法中，固定转化率α所对应的的表观活化能，以lnβ对1/Tm作图拟合性分析，得到直线斜率后对应-1.052Eo/R可以计算出活化能Eo。

1.3.4 低聚糖热解机理的判定

由公式（8）得到公式（9）。

根据杨鹏等[25]的方法采用同一温度所对应的转化率α与不同升温速率，通过化合物热分解最常用的30 种最概然机理函数的积分形式G（α），以lng（α）对lnβ作图，用最小乘二法进行线性拟合获取线性较好且斜率接近-1所对应的机理函数，即为该反应的最概然机理函数，并将其带入公式（10）得到指前因子A。

1.3.5 热解过程动力学参数计算

根据Lei Zhihui等[26]的方法，用KAS法求得Ea和lnA后，热力学参数焓变（ΔH）、吉布斯自由能（ΔG）和熵变（ΔS）分别由公式（11）～（13）计算。

式中：KB为波尔兹曼常数（1.381×10-23J/K）；h为普朗克常数（6.626×10-34J·s）。

1.4 数据处理与分析

采用TA Universal Analysis软件对数据进行处理与分析，利用Origin 9.0软件处理数据并作图。

2 结果与分析

2.1 低聚糖HPLC分析结果

由图1A可知，用质量分数为2%的D-果糖、D-甘露糖和葡萄糖作为标准样品，出峰时间分别在8.47、8.89 min和9.65 min左右，图1B中质量分数为10%低聚果糖和图1C中质量分数为40%葡甘露低聚糖，与图1A中质量分数为1%单糖的峰面积对比分析，结果表明两种低聚糖中单糖质量分数均低于1%。

图 1 单糖与低聚糖高效液相色谱图Fig. 1 High performance liquid chromatography analysis of monosaccharide and oligosaccharide standards

2.2 低聚糖热重分析结果

根据程泽[27]和陈颖钦[28]等对单糖热分解研究，由图2A、B中DTG曲线可知，单糖的分解峰温比低聚糖的分解峰温低，说明单糖比低聚糖更易分解。鉴于单糖相关研究的基础，本实验主要突出比较两种低聚糖的热分解稳定性。

图 2 低聚糖和单糖的TG曲线与DTG曲线Fig. 2 Thermogravimetry and differential thermogravimetry curves of oligosaccharides at different heating rates

由图2C、D可以看出，在不同升温速率下两种低聚糖的热重（thermogravimetry，TG）曲线与DTG曲线变化的趋势保持一致，由于热滞后和传热限制的影响，TG曲线随加热速率的增加而横向移动，DTG曲线的峰形越来越突出，通过最大升温速率20 ℃/min可以看出[29]。两种低聚糖的热解过程大致可以分为3 个阶段：第一阶段，在30～100 ℃内主要是脱去水分，由TG曲线呈现出微小下降，DTG曲线出现平峰（失水峰）；第二阶段和第三阶段，在160～370 ℃内，TG曲线呈现大幅度下降，由DTG曲线可看出两种低聚糖包含一个尖峰和一个单肩峰并且有部分重叠，由表1峰温数据可知，两个阶段的峰温值相差不大，第二阶段的质量损失速率大于第三阶段的质量损失速率，说明在第二阶段低聚糖分子主要以熔融和分解体为主，葡甘露低聚糖不同分子质量的聚合物解聚成单糖及包含少量葡萄糖的聚合物，而低聚果糖中果四糖、果五糖解聚成果二糖和果三糖，果二糖和果三糖能迅速形成结晶固体状物[30-31]，第三阶段对解聚后的产物进一步分解成碳和气体。在370 ℃之后，TG曲线和DTG曲线都呈现缓慢变化直至趋于平直。

表 1 不同升温速率下低聚糖的热解参数Table 1 Pyrolysis parameters of oligosaccharides at different heating rates

两种低聚糖的热解参数如表1所示，由不同速率下低聚糖热解参数可知，两种低聚糖的Ti和Tm随着升温速率的增加而升高，而Tf无明显变化，说明两种低聚糖的热解温度范围相差不大。在所有升温速率条件下，低聚果糖的Rmax最高，这表明低聚果糖的热解机理相对简单，热分解过程相对较快[32]。在不同升温速率下两种低聚糖的Mf都很低，相差不大，表明Mf不受升温速率的影响。

图 3 不同升温速率下低聚糖热解过程转化率曲线Fig. 3 Curves of α versus T of oligosaccharide pyrolysis at different heating rates

图3为低聚糖热解实验得出的转化率与温度的曲线，随着温度的升高，转化率逐渐增大，相同转化率的条件下，升温速率越快对应的温度则越高。该曲线是后续分析热解非等温无模式函数法的基础。

2.3 低聚糖动力学分析结果

表 2 用Kissinger法和FWO法分别计算低聚糖热分解活化能Table 2 Activation energy of oligosaccharide thermal decomposition calculated by Kissinger method and FWO method, separately

图 4 低聚糖在不同转化率下ln（β/T2）与1/T的曲线Fig. 4 Curve of ln (β/T2) against 1/T of oligosaccharides at different conversion rates

根据低聚糖的DTG曲线，用Kissinger、FWO法和KAS法分别对第二阶段和第三阶段进行分析。根据表2可知，分别采用Kissinger法和FWO法计算得到表观活化能Ek和Eo，Kissinger法没有考虑机理函数以线性拟合后截距求得指前因子A，FWO法根据最概然机理函数求得指前因子A，两个方法计算的结果相差不大，葡甘露低聚糖第二阶段的活化能低于低聚果糖第二阶段的活化能，而第三阶段的活化能高于低聚果糖第三阶段的活化能，表明葡甘露低聚糖第二阶段更易分解，第三阶段更难分解，由于计算存在误差，为避免有误差的可能性，取Kissinger法和FWO法的平均值作为分解的活化能以及指前因子，葡甘露低聚糖第二阶段和第三阶段的活化能及指前因子分别为114.73 kJ/mol、24.30 min-1和156.05 kJ/mol、32.95 min-1，低聚果糖第二阶段和第三阶段的活化能及指前因子分别为138.65 kJ/mol、32.03 min-1和145.92 kJ/mol、31.73 min-1。由TG-DTG曲线以及表1可知，由于需要考虑葡甘露低聚糖和低聚果糖成分的有效性，在加工、贮藏、运输以及应用等过程中，本实验主要以第一个分解温度进行分析，保证低聚糖有效成分最大利用。根据Yang Hang等[33]的研究方法，本实验第二阶段选取α为0.15～0.95，第三阶段选取α为0.05～0.60，排除线性相关性差的转化率，并以0.05为间隔进行分析，通过公式（9）以ln（β/T2）对1/T作图，分别对两种低聚糖第二阶段和第三阶段进行线性拟合性分析，如图4所示，结果表明两种低聚糖用KAS法分析均具有较好的线性相关性，R2均大于0.97。

图 5 KAS法在不同转化率下获得的低聚糖的活化能Fig. 5 Activation energy of oligosaccharides obtained by KAS method at different conversion rates

图5为不同转化率下用KAS法获得两种低聚糖活化能的对比图，由图5A可知，第二阶段葡甘露低聚糖活化能基本保持不变，低聚果糖活化能呈上升的趋势。Forgo等[30]的研究表明果糖的热稳定性不如葡萄糖和甘露糖，第二阶段两种低聚糖活化能表明低聚果糖中果二糖和果三糖迅速结晶导致其活化能偏高。由图5B可知，两种低聚糖在第一个分解峰温之后，随着温度升高，聚合物进一步解聚成单糖，为了达到第二个分解峰温，活化能进一步升高，结果表明葡甘露低聚糖的活化能高于低聚果糖活化能，说明葡甘露低聚糖的热稳定性高于低聚果糖。

2.4 低聚糖热分解机理

表 3 低聚糖最概然机理函数拟合结果Table 3 Most probable mechanism functions of oligosaccharides

表3为葡甘露低聚糖和低聚果糖热解机理函数拟合结果，本实验分别以同一温度所对应的α值带入最常用的30 种机理函数的积分形式G（α）进行拟合性分析，选取斜率接近-1且拟合性较好的方程。结果表明，葡甘露低聚糖热解反应第二阶段的机理函数为G（α）＝[1-（1-α）1/3]2，该阶段的热解机理为三维扩散和球形对称的Jander方程；第三阶段的机理函数为G（α）＝[-ln（1-α）]4，该阶段的热解机理为随机成核和随后生长，遵循Avrami-Erofeev方程。低聚果糖热解反应第二阶段的机理函数为G（α）＝1-（1-α）4；第三阶段的机理函数为G（α）＝[-ln（1-α）]2，该阶段的热解机理为随机成核和随后生长，遵循Avrami-Erofeev方程。

2.5 低聚糖热分解的热力学参数

表4为两种低聚糖用KAS法线性拟合分析，本实验选取拟合性较好的直线斜率来获得表观活化能，R2均在0.98以上，根据相关热力学公式进行计算求得热力学参数。葡甘露低聚糖热解第二阶段和第三阶段各转化率的Ea，平均值分别为114.42、163.77 kJ/mol，低聚果糖两个阶段的Ea分别为137.22、144.95 kJ/mol，通过与Kissinger法和FWO法分析得到的活化能进行比较，3 种方法分析得到的Ea相差不大；葡甘露低聚糖的第二和三阶段的lnA，平均值分别为26.08、34.82 min-1，低聚果糖两个阶段的lnA分别为32.02、31.83 min-1，同样与之前两种方法分析得到的lnA相差不大，由于实验计算可能存在误差，取3 个方法的平均值作为本实验研究的结果，即葡甘露低聚糖第二阶段和第三阶段的Ea及lnA分别为114.58 kJ/mol、25.19 min-1和159.91 kJ/mol、33.89 min-1，低聚果糖第二阶段和第三阶段的Ea及l nA分别为137.94 kJ/mol、32.03 min-1和145.44 kJ/mol、31.78 min-1。Gupta等[34]研究报道称指前因子A＜109s-1（＜20.72 min-1）表示化合物表面控制反应，而A＞109s-1（＞20.72 min-1）表示简单的化合物表面自由运动反应，A值越高表示该化合物分解更慢。两种低聚糖第二阶段lnA变化不大，均大于20.70 min-1，所以两种低聚糖不受表面控制反应，而在第三阶段两种lnA变化较大，其中葡甘露低聚糖的lnA更大，表明葡甘露低聚糖热解更缓慢，同时两种低聚糖热解机理发生的变化与表3两阶段不同热解机理相符合。

另外，热力学参数ΔG、ΔH、ΔS均为温度的状态函数。随着温度的升高，两种低聚糖各阶段的ΔG、ΔH均大于0，说明两个阶段的热解反应需要吸收大量的热。葡甘露低聚糖第二阶段ΔS均为负值，表明该过程中低聚糖的解聚分解呈有序进行，相反，葡甘露低聚糖第三阶段和低聚果糖第二、三阶段ΔS均有正负值，表明葡甘露低聚糖解聚后产生的葡萄糖使成分热解需要更多的热量且更加复杂化，而低聚果糖ΔS初始阶段为负值，表明低聚果糖中果三糖复合物水平增加并快速结晶呈有序性进行。

表 4 低聚糖动力学和热力学参数Table 4 Kinetic and thermodynamic parameters of oligosaccharides

3 结 论

本实验采用热重分析仪以5、10、15、20 ℃/min非等温升温速率，对葡甘露低聚糖和低聚果糖的热解性质进行分析，两种低聚热解过程分为3 个阶段，且分解峰温在220～300 ℃，分别用Kissinger、KAS、FWO 3 种热力学分析方法分析比较两种低聚糖的热稳定性，第二阶段低聚果糖和葡甘露低聚糖的活化能分别为137.94 kJ/mol和114.58 kJ/mol，结果表明低聚果糖中果二糖和果三糖迅速结晶导致其活化能偏高，第三阶段低聚果糖和葡甘露低聚糖的活化能分别为145.44 kJ/mol和159.91 kJ/mol，随着温度进一步升高，两种低聚糖解聚成单糖，结果表明葡甘露低聚糖热稳定性高于低聚果糖。低聚果糖和葡甘露低聚糖lnA分别为32.03、31.78 min-1和25.19、33.89 min-1；分析葡甘露低聚糖和低聚果糖的热解机理函数，第二阶段和第三阶段分别为G（α）＝[1-（1-α）1/3]2、G（α）＝[-ln（1-α）]4和G（α）＝1-（1-α）4、G（α）＝[-ln（1-α）]2；热力学参数葡甘露低聚糖第二阶段和三阶段的ΔH为110.13 kJ/mol和159.11 kJ/mol，低聚果糖第二阶段和三阶段的ΔH为132.99 kJ/mol和140.46 kJ/mol。葡甘露低聚糖和低聚果糖热稳定性及动力学机理的比较分析，为其在食品、医药领域的应用提供理论参考依据。