王 宁，袁美丽，安瑞云

(1.河南科技大学林学院，河南 洛阳 471023；2.洛阳市隋唐城遗址植物园，河南 洛阳 471002)

低温是影响植物区域性分布的重要限制因素[1-3]。轻度低温胁迫会影响植物叶、茎等形态指标以及生物量的变化，而严重低温会引起植物新陈代谢紊乱甚至导致植株死亡[4-5]。光合作用是植物生长发育的基础，也是植物对低温较为敏感的生理过程之一。叶绿素荧光能探测植物叶片的光合能力及热耗散情况，因此环境变化对植物光合过程的影响可通过叶绿素荧光特性来反映[6]。与常见植物抗逆性研究中利用的电导法、组织褐变法和氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride, TTC)还原法相比，叶绿素荧光分析技术不仅具有快速、灵敏的特性，更重要的是可无损伤的探测逆境条件下完整植株的光合作用情况，因此被广泛应用于植物光合结构功能及其对环境胁迫适应性的评价研究[7]。

樟[Cinnamomumcamphora(L.) J. Presl]是珍贵的经济树种,根据其樟油化学成分不同，可分本樟(camphor-type)(含樟脑为主)，芳樟(linalool-type)(含芳樟醇为主)和油樟(terpineol-type)(含松油醇为主)3个类型。我国北方地区的常绿阔叶树种相对匮乏，开展樟属植物抗寒性研究，可为樟树耐寒品种选育及北方地区常绿阔叶树种的引种应用提供参考。目前，已有从叶片解剖结构[8-9]及SOD等生理生化指标方面[10]对多种樟树的抗寒性进行了研究，并对自然降温过程中猴樟(C.bodinieriLévl)和芳樟[C.camphora(linalool-type)]的叶绿素荧光参数变化进行了探讨[11]，但通过人工设置低温结合叶绿素荧光分析技术进行不同种樟树的抗寒性研究尚未见有报道。为此，通过人工模拟低温环境，从叶绿素、抗氧化酶系统、渗透调节物质以及叶绿素荧光参数等方面，比较芳樟和油樟[C.camphora(terpineol-type)]抗寒性强弱，旨在为耐寒樟树品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为1 年生实生油樟和芳樟幼苗，种子均来源于湖南省长沙县跳马镇。试验地位于河南省郑州市河南农业大学第三生活区，北纬34°16′，东经112°42′，属北温带大陆性季风气候，年均气温15.6 ℃，1月份最冷，月平均气温2.15 ℃，年均降雨量649.9 mm。2018年8月，选择生长健康的植株移栽至花盆内(盆口直径25 cm，高30 cm)，1株 · 盆-1，盆土为沙壤土。缓苗1周后进行常规日常管理。

1.2 研究方法

1.2.1 低温胁迫 2018年8月15日，选择长势良好、大小相近的2种樟树幼苗各60盆，移入人工气候室(浙江大学电器设备厂)，于20 ℃、光照12 h· d-1的条件下培养5 d。之后，设置降温速度为2 ℃· h-1，分别降温到0、6、12 ℃，并低温胁迫0(CK)、2、4、6 d进行抗寒指标的测定。

1.2.2 指标测定 利用便携式调制叶绿素荧光仪Mini-PAM(德国Walz公司)进行叶绿素荧光参数的测定。每盆选取植株下部成熟叶2片，每处理测定5株。首先，用暗适应叶夹处理待测叶片，暗适应30 min，获取初始荧光(F0)、最大荧光(Fm)。并求出光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ，PSⅡ)最大光化学效率(Fv/Fm)，Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm。

每处理随机选取3盆植株，每株选取3片健康成熟的功能叶片进行生理指标的测定。采用质量分数为95%乙醇法测定叶绿素(chlorophyll，Chl)含量；酸性茚三酮法测定脯氨酸(proline，Pro)含量；氮蓝四唑光还原法测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性；硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；电导法测定相对电导率(relative conductivity，REC)[12]。

1.2.3 耐寒性评价 利用模糊隶属函数法[13-15]对2种樟树叶绿素荧光参数及生理指标进行分析，计算每项指标的隶属值，公式如下:

f(xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

f(xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：Xi为指标测定值，Xmax、Xmin分别为该指标的最大值和最小值。若某一指标性状与抗寒性呈正相关，选用公式(1)，若呈负相关则用公式(2)。根据上述公式计算每一指标在不同低温胁迫下的隶属值，最后把同一树种各项耐寒指标隶属函数值累加，取平均值为综合评价值(D)，D值越大，耐寒性越强。

1.3 数据处理与分析

使用SPSS 18.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对2种樟树抗寒生理指标的影响

2.1.1 叶绿素含量 随胁迫时间的延长，不同低温处理下油樟和芳樟的叶绿素含量整体均呈下降的趋势(表1)。其中，6和12 ℃条件下，处理2、4和6 d，2种樟树的叶绿素含量与CK相比差异均不显著；0 ℃条件下6 d时，油樟和芳樟的叶绿素含量分别较CK下降了17.38%和33.33%，其中，油樟的叶绿素含量与CK差异不显著，而芳樟则与CK差异达到显著水平(P<0.05)。由此说明，0 ℃条件下连续6 d的低温胁迫已对芳樟的叶绿素合成及降解或叶绿体结构造成了一定的负面影响。

表1 低温胁迫对2种樟树叶绿素含量的影响Table 1 Effect of low temperature on chlorophyll content in the leaves of the two camphor species

2.1.2 超氧化物歧化酶活性 从表2可看出，不同低温处理下，2种樟树的SOD活性均随胁迫时间的延长呈持续增加的趋势，表明2种樟树的SOD活性均参与了其低温胁迫的响应过程。与CK相比，至第6天时，6和12 ℃条件下2种樟树的SOD活性增加均未达到显著水平；0 ℃条件下至第6天时，油樟的SOD活性与CK差异显著(P<0.05)，而芳樟则未达到差异显著水平，此外，至第6天时，油樟SOD活性的增幅为38.10%，明显大于芳樟的30.35%。由此表明，油樟通过增加SOD活性清除由于低温胁迫所产生活性氧自由基的能力大于芳樟。

表2 低温胁迫对2种樟树SOD活性的影响Table 2 Effect of low temperature on SOD activity in the leaves of the two camphor species

2.1.3 丙二醛含量 不同低温处理下，2种樟树的MDA含量均随胁迫时间的延长而呈持续增加的趋势(表3)。其中，6和12 ℃条件下，2、4和6 d时，2种樟树的MDA含量与CK相比差异均不显著；0 ℃条件下至第6天时，油樟和芳樟的MDA含量分别较CK增加了26.06%和63.03%，其中，芳樟MDA含量与CK差异达到显著水平(P<0.05)，而油樟的MDA含量与CK差异不显著。由此表明，连续6 d的0 ℃低温胁迫已一定程度地造成了芳樟叶片细胞膜质过氧化损伤。

2.1.4 相对电导率 随胁迫时间的延长，不同低温处理下2种樟树的相对电导率均呈逐渐增加的趋势(表4)。其中，12 ℃条件下，2、4和6 d时，油樟和芳樟的相对电导率与CK差异均不显著；6 ℃条件下，2、4和6 d时，油樟相对电导率与CK差异不显著，而第6天芳樟则达到差异显著水平(P<0.05)；0 ℃条件下，油樟在胁迫至第6天时与CK差异显著，而芳樟则在第4天时与CK差异达到显著水平(P<0.05)。结果表明，低温对2种樟树叶片细胞膜透性造成了一定影响，随处理温度的下降及胁迫时间的延长，电解质的外渗呈逐渐增加的变化，但2种樟树间又存在一定的差异，这可能与它们的低温适应能力不同有关。

表3 低温胁迫对2种樟树MDA含量的影响Table 3 Effect of low temperature on MDA content in the leaves of the two camphor species

表4 低温胁迫对2种樟树相对电导率的影响Table 4 Effect of low temperature on relative conductivity in the leaves of the two camphor species

2.1.5 脯氨酸含量 随胁迫时间的延长，不同低温处理下油樟和芳樟叶片内脯氨酸含量均呈持续增加的趋势(表5)。但直至胁迫6 d时，0、6及12 ℃处理下2种樟树脯氨酸含量与CK差异均未达到显著水平。其中，0 ℃条件下胁迫至6 d时，油樟脯氨酸含量较CK增加了22.65%，高于芳樟的22.18%。

表5 低温胁迫对2种樟树脯氨酸含量的影响Table 5 Effect of low temperature on proline content in the leaves of the two camphor species

2.2 低温胁迫对2种樟树叶绿素荧光参数的影响

2.2.1 初始荧光(F0) 从表6可看出，12 ℃条件下，2种樟树的F0均呈先降后升的趋势，而0和6 ℃条件下，则均呈持续增加的变化。其中，12 ℃条件下至第6天时，油樟和芳樟的F0与CK差异均不显著；6 ℃条件下，油樟F0在第6天与CK差异不显著，而芳樟则是在胁迫的第6天与CK差异达到显著水平(P<0.05)；0 ℃条件下，油樟和芳樟F0分别在胁迫的第6天及第4天时与CK差异达到显著水平(P<0.05)，至第6天时，分别较CK增加了29.69%、59.60%。由此表明，12 ℃条件下短时间的低温胁迫并未对2种樟树PSⅡ反映中心造成伤害，F0的降低可能是PSⅡ的热耗散增加所致，之后，随着胁迫温度下降及时间延长，F0均呈持续增加的变化，表明低温胁迫已对PSⅡ反映中心造成了一定的伤害。

2.2.2 最大光化学效率(Fv/Fm) 随胁迫时间的延长，不同低温处理下2种樟树Fv/Fm呈持续下降的趋势(表7)。其中，6和12 ℃条件下至第6天时，油樟和芳樟的Fv/Fm与CK差异均不显著；0 ℃条件下至第6天时，油樟的Fv/Fm与CK差异不显著，而芳樟则达到差异显著水平(P<0.05)。

表6 低温胁迫对2种樟树初始荧光(F0)的影响Table 6 Effect of low temperature on initial fluorescence in the leaves of the two camphor species

表7 低温胁迫对2种樟树最大光化学效率(Fv/Fm)的影响Table 7 Effect of low temperature on maximum photochemical efficiency of PSⅡ in the leaves of the two camphor species

2.3 耐寒性综合评价

利用隶属函数法求出油樟和芳樟叶绿素含量、相对电导率、脯氨酸、MDA含量以及Fv/Fm等7个指标的隶属值，累加后得出每种樟树的平均隶属值，即综合评价值(D)，D值越大则耐寒性越强。根据综合评价值可知(表8)，油樟的耐寒性大于芳樟。

表8 低温胁迫下2种樟树个指标隶属函数值、综合评价值及排序Table 8 Subjective function value, comprehensive evaluation value(D), and order of the two camphor species under cold stress

3 讨论与结论

低温会导致叶绿体的降解，并抑制叶绿素的合成，因此叶绿素含量的稳定性一定程度上反映了低温胁迫对植物的伤害程度[16-18]。本研究中，随胁迫时间的延长，不同低温条件下2种樟树的叶绿素含量呈逐渐下降的变化趋势，表明低温胁迫对其叶绿素的合成及降解产生了一定的影响。但仅在0 ℃条件下胁迫至第6天时，芳樟叶绿素含量较CK下降达到显著水平(P<0.05)，由此表明，与芳樟相比，相同低温条件下油樟依然可保持相对稳定的叶绿素含量，从而有利于其光合作用，达到减轻低温胁迫对其造成的伤害。

相对电导率的改变反映了细胞膜透性的变化，逆境条件下植物细胞膜透性增大，细胞内电解质外渗增加，造成电导率的增大[19-21]。MDA作为膜质过氧化反应的最终产物，其含量成为膜质受伤害程度的重要反映指标。CAMPOSetal[22]认为MDA的含量反映了膜质过氧化水平，以及细胞膜受损程度和植物逆境胁迫的抵御能力。而SOD作为植物体内重要的活性氧自由基清除酶，其活性大小与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关，因此MDA含量及SOD活性常被作为植物抗逆性的重要评价指标[23]。本研究中，2种樟树的相对电导率随胁迫温度的下降及处理时间的延长均呈持续增加的变化，表明低温胁迫导致了二者叶片细胞膜透性的逐渐增大。此外，6 ℃条件下至第6天时，芳樟相对电导率与CK差异显著，而油樟差异不显著；0 ℃条件下，油樟和芳樟分别在第6天及第4天时与CK差异达到显著水平(P<0.05)。此外，2种樟树的MDA含量及SOD活性均随处理温度降低及胁迫时间延长呈持续增加的变化。且0 ℃条件下至第6天时，芳樟的MDA含量较CK增加显著(P<0.05)，且此胁迫条件下油樟的SOD活性较CK增加显著(P<0.05)，而芳樟则不显著，且油樟SOD活性大于芳樟。由此表明，芳樟SOD保护酶对低温胁迫产生的活性氧自由基清除能力小于油樟，致使其膜质过氧化水平大于油樟，从而造成其受低温胁迫程度的增大。

逆境条件下，植物通过增加体内脯氨酸等渗透调节物质含量维持细胞的膨胀状态，从而达到降低水势和保持某些生物大分子活性以减轻植物细胞的胁迫损伤[24]。本研究中，低温胁迫中油樟和芳樟的脯氨酸含量均呈持续增加的变化，表明2种樟树均通过脯氨酸含量的增加抵御外界低温的持续胁迫。与芳樟相比，相同条件下油樟脯氨酸含量增加更为明显，这可能与其耐寒性较强有关。

初始荧光(F0)由PSⅡ捕光叶绿素蛋白复合物发出，一般情况下，数值保持稳定，当光合机构受到破坏时则会升高[25]。Fv/Fm值的大小可反映PSⅡ原初光能转换效率的高低，因此常被用于植物的抗逆性研究。Fv/Fm值降低表明植物受到光抑制，低温胁迫下变化幅度越小表明植物耐低温能力越强[26]。本研究中，12 ℃条件下油樟和芳樟的F0呈先升后降的变化，而Fv/Fm则均呈下降的变化，但至第6天时，F0和Fv/Fm与CK差异均不显著，表明12 ℃的低温虽然影响了2种樟树的正常光合作用过程，使PSⅡ原初光能转化效率短暂下降，但潜在活性中心并未受损。之后，油樟F0和Fv/Fm在0 ℃条件下至第6天时与CK差异达到显著水平；而芳樟则分别在6 ℃条件下至第6天时及0 ℃条件下至第4天时与CK差异达到显著水平。由此可知，相同条件下2种樟树的PSⅡ反应中心受低温胁迫的损伤程度因其耐寒性不同而存在一定差异，其中又以油樟对同等低温胁迫的适应能力较强。

植物的抗寒性是受多因素共同影响的复杂生理过程，而隶属函数分析则是在多指标测定基础上，对植物耐寒性进行综合评价的简单且有效地方法，且可避免使用某单一指标进行评价而造成的片面性，因此，隶属函数法作为有效的评价方法被广泛应用于如核桃[27]、板栗[28]等植物的抗寒性评价研究。本研究依据隶属函数法计算了与樟树耐寒性关系密切的SOD、MDA以及F0、Fv/Fm等7个指标的平均隶属度，对2种樟树耐寒性进行了综合评价分析，表明油樟的耐寒性大于芳樟。本研究仅在室内条件下，从不同低温及持续时间两方面，结合生理生化指标的测定证实了油樟耐寒性大于芳樟，而北方地区的冬季低温不仅有极端最低温，还包括骤然降温及升温等多种情况，因此不同种樟树在北方地区的引种应用还需更深一步的研究。