贾琰 杨亮 邹德堂 瞿炤珺 王敬国 刘化龙 王晋 赵宏伟

(1 东北农业大学 寒地粮食作物种质创新与生理生态教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2 东北农业大学 农学院，哈尔滨 150030；3 北大荒垦丰种业股份有限公司，哈尔滨 150431；#共同第一作者；*通信联系人，E-mail: hongweizhao_cool@126.com)

水稻是重要的粮食作物，黑龙江省作为我国粳稻第一大省，对保障国家粮食安全至关重要[1]。孕穗期低温冷害是限制水稻产量提高的重要因素[2]。据统计，黑龙江省平均每3～5年就发生一次较大的低温冷害[3]，低温冷害已经成为限制寒地粳稻生产、提质增效的关键因素之一。

逆境胁迫影响作物氮代谢水平[4]。研究证实，孕穗期冷水胁迫影响寒地粳稻氮代谢及氮素吸收积累及转运过程，进而影响光合产物生产，导致产量降低[2,5]。逆境胁迫下，植物体内Ca2+作为信号传导物质激发细胞内谷氨酸脱羧酶(GAD)，使其催化L-谷氨酸(L-Glu)发生不可逆的脱羧反应形成GABA，进而使GABA 含量上升[6]。逆境胁迫下外源施用γ-氨基丁酸(GABA)[7-11]、氯化钙(CaCl2)[12-17]和谷氨酸(Glu)[18]均可通过调节植物的氮代谢水平进而提高植物的耐逆性，外源施用GABA 能够促进植物体内脯氨酸积累[19]，增强抗氧化防御系统抵御逆境的能力[7-11]；外源施用CaCl2植物体内脯氨酸含量[15]、GABA 含量及GAD 活性[16,17]显著提高，耐逆性增强；外源增施Glu 可使低温胁迫下大麦幼苗中GABA 含量升高，耐冷性增强[18]。此外，苗期低温胁迫下外源施用最适浓度配比GABA、CaCl2和Glu 可以显著提高寒地粳稻耐冷性[20]。因此，研究如何调控孕穗期冷水胁迫下寒地粳稻氮代谢水平进而减轻低温冷害对寒地粳稻产量的影响，对确保黑龙江省粮食总产稳步上升及保证国家粮食安全具有十分重要的意义。

C3作物中水稻的氮光合效率(PNUE)最高[21-22]，提高叶片的氮光合效率将有助于提高作物的产量[23]。是否可以通过施用GABA、CaCl2和Glu 复配剂(CGG)提高孕穗期冷水胁迫下寒地粳稻叶片PNUE，进而减轻低温冷害对寒地粳稻光合产物生产的影响，实现保产增效的目的，目前尚缺乏明确认识。本研究拟用生育期相近的2个粳稻品种为试验材料，通过研究孕穗期冷水胁迫下外源施用CaCl2、Glu、GABA单剂及复配剂对寒地粳稻产量相关指标的影响，筛选出CGG最适配比，揭示孕穗期冷水胁迫下施用最适配比CGG对寒地粳稻氮光合效率及产量形成的调控效应，为建立有效抵御低温冷害的化控栽培技术提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验地点与条件

试验于2014 年至2017 年在黑龙江省东北农业大学植物实验实习基地进行。供试土壤为黑土，土壤基础肥力如表1。

1.2 试验材料与设计

选用粳稻品种东农428(冷水处理空壳率为7.93%～9.00%)和松粳 10(冷水处理空壳率为14.98%)为材料。于2014 年进行GABA、CaCl2和Glu 三种外源物质单剂最适浓度筛选，试验采用裂区试验设计，以CaCl2、Glu、GABA 浓度为主区(表2)，水稻品种为副区，正常灌溉为对照(T0)，副区面积为18 m2，行长3 m，行距30 cm，穴距13.3 cm，主区间筑大埂隔离。孕穗期 17℃冷水胁迫7 d，连续施用不同浓度的三种外源物质，筛选最适施用浓度。于幼穂长约为1 cm 时进行孕穗期冷水处理(温度为17℃，水层深度为20 cm)。17℃冷水为地下深井水(8 ℃～9 ℃)与晒水池水(22 ℃～24℃)混合后形成，采用智能控温冷水灌溉系统进行田间冷水灌溉，正常灌溉为晒水池水，其他管理同大田生产。

表1 土壤基础肥力（2014-2017）Table 1.Soil properties of composite topsoil samples (0-20 cm) from the main experimental plots (2014-2017).

表2 孕穗期冷水胁迫下外源物质施用浓度Table 2.Exogenous substance concentrations under cold-water stress during booting stage.

表3 因子编码及实际值Table 3.Factor code and actual level.

表4 中心组合设计因素水平与编码表Table 4.Central composite design code of factors.

于2015 年进行中心组合试验，筛选三种外源物质最适浓度复配剂。试验采用裂区试验设计，外源物质浓度复配剂为主区(表3～4)，水稻品种为副区，常温灌溉为对照，副区面积为18 m2，行长3m，行距30 cm，穴距13.3 cm，主区间筑大埂隔离。孕穗期 17℃冷水胁迫7 d，连续施用不同浓度配比的三种外源物质，筛选最适施用浓度配比。其他田间处理同2014 年。

于2016-2017 年进行孕穗期冷水胁迫下施用外源物质对寒地粳稻氮光合效率及产量形成的调控效应，采用裂区试验设计，最适外源物质浓度复配剂为主区，水稻品种为副区，常温灌溉为对照，副区面积为18 m2，行长3 m，行距 30 cm，穴距 13.3 cm，主区间筑大埂隔离。孕穗期 17℃冷水胁迫7 d，连续施用最适浓度配比的三种外源物质。其他田间处理同2015 年。试验期间(2014-2017 年)田间气象条件如表5。

1.3 试验方法

1.3.1 花粉粒活性、颖花及枝梗数

在田间选取生长整齐一致的植株挂牌标记，于齐穗期9:00-11:30 在田间选取主茎穗，各处理选3 穴，每穴取3 穂，选取每穗顶部3 个一次枝梗中上部颖花，用于花粉粒活性测定，利用碘-碘化钾(I2-KI)染色法测定花粉粒活性[24]。

表5 孕穗期冷水灌溉期间田间试验条件Table 5.Survey of testing site conditions during cold-water irrigation at booting stage.

在田间选择生长整齐一致的植株挂牌标记，于齐穗期取植株主茎稻穗，每处理选3 穴，每穴取3穗，参照刘利等[25]的方法，观察每穗枝梗数及颖花数。

1.3.2 氮光合效率及产量形成相关指标

选取各处理同日抽穗的稻穗挂牌标记，每个小区随机选取3 株水稻，3 次重复，用CI-340(CID, 美国)便携式光合测定仪测定水稻齐穗期叶片的净光合速率，用手持式CID-203 便携式叶面积仪(CID,美国)测定叶片面积。取齐穗期水稻叶片，105℃下杀青后烘干至恒重用于氮素含量测定，采用半微量凯氏定氮法测定叶片氮素含量[26]。分别于齐穗期和成熟期取地上部植株，各小区中选3 穴，3 次重复。在105℃下杀青30 min 后，80℃下烘至恒重后称重。

1.3.3 产量测定

成熟期调查有效穗数，每小区按其平均数取代表性植株5 穴室内考种，测定每穗粒数、结实率及千粒重；小区单打单收，按实收穴数计产。

1.3.4 计算方法

1)比叶质量(LMA, mg·cm−2)[27]=叶片干物质量/叶面积；

2)单位面积氮含量(Narea, mg·cm−2)=单位面积叶片氮素含量/叶面积；

3)氮光合效率(PNUE, μmol·mol−1s−1)[28]=净光合速率/单位面积氮含量；

4)群体生长率(CGR, g·m−2d−1)＝(成熟期植株地上部干物质量−齐穗期植株地上部干物质量)/齐穗期至成熟期天数；

5)温度生产效率(g·m−2℃−1)[29]=单位面积地上部生物产量/生育期间有效积温；

6)外源物质对温度效率差的贡献率(%)=[(冷水胁迫下施用外源物质温度生产效率−冷水胁迫温度生产效率)/(潜在温度生产效率−冷水胁迫温度生产效率)]×100，其中潜在温度生产效率计算参考赖荣生等[30]的方法；

7)冷水反应指数(%)=冷水处理下各指标测定值/对照处理下各指标的测定值×100%。

1.4 数据统计分析

用Microsoft Excel 2016、Design-expert 8.05 和SPSS 25.0 统计软件对上述结果进行作图及统计分析。

2 结果与分析

2.1 筛选孕穗期冷水胁迫下CaCl2、Glu、GABA的最适施用浓度

2.1.1 孕穗期冷水胁迫下施用CaCl2、Glu、GABA单剂最适浓度的筛选

由表6 可知，孕穗期冷水胁迫下外源施用CaCl2、Glu、GABA 可在一定程度上提高寒地粳稻产量，减轻冷水胁迫对寒地粳稻的损伤，其中T1+G2和T1+G3处理下(外源施用2.5 mmol/L 和3.75 mmol/L)、T1+Glu2和T1+Glu3处理下(外源施用1.50 mg/mL 和2.25 mg/mL)、T1+C2和T1+C3处理下(外源施用2.0 mmol/L 和3.0 mmol/L)寒地粳稻产量较高。

表6 孕穗期冷水胁迫下施用CaCl2、Glu 和GABA 对寒地粳稻产量相关指标的影响Table 6.Effects of exogenous CaCl2, Glu and GABA on yield related indexes of cold-regionjaponicarice under cold water stress at booting stage.

通过隶属函数分析法可知(表7)，孕穗期冷水胁迫下单独施用CaCl2、Glu、GABA，寒地粳稻8个与产量相关指标隶属函数及隶属函数平均值(ASFV)均高于冷水胁迫处理，但较正常灌溉水平低。与冷水胁迫对照相比，在T1+G3处理、T1+Glu2和T1+Glu3处理以及T1+C3处理下东农428 寒地粳稻隶属函数值最高；在T1+G3处理、T1+Glu2处理以及T1+C2和T1+C3处理下松粳10 隶属函数值最高。

由图1 可知，y值为东农428 和松粳10 ASFV的平均值，x表示三种外源浓度，三种外源浓度与寒地粳稻 ASFV 平均值呈极显著正相关关系(R2GABA=0.953**;R2Glu=0.8925**;R2CaCl2=0.8616**)，4.41 mmol/L GABA、1.97 mg/mL Glu 和2.58 mmol/L CaCl2处理效果较好，ASFV 值最大(0.35、0.35、0.33)。为便于试验操作，选用三种外源物质的临界最优值用于三种外源物质最适浓度配比筛选实验。因此，分别选用4.5 mmol/L GABA、2.0 mg/mL Glu和2.60 mmol/L CaCl2作为最适单剂浓度。

2.1.2 孕穗期冷水胁迫下CaCl2、Glu、GABA 的最适施用浓度配比筛选

将最适浓度配比的三种外源物质CaCl2、Glu、GABA 简称为CGG。由于外源施用对孕穗期冷水胁迫下寒地粳稻耐冷性的较为复杂，单一的指标并不能完全、客观地反应外源施用CGG 对孕穗期冷水胁迫下寒地粳稻实际抗冷性的影响，因此本研究通过隶属函数分析法，计算出可育花粉率、结实率、千粒重、产量4 个指标的隶属函数值和其平均隶属函数值(ASFV)，综合评价外源施用CGG 对寒地粳稻耐冷性的影响，筛选出外源CGG 的最适浓度配比(如表8 和9)。研究结果表明，外源施用CGG 浓度配比为1.87 mmol/L CaCl2、2.76 mg/mL Glu、4.40 mmol/L GABA，ASFV 值最大，为0.932(如表8 和图2)。表明施用最适浓度CGG 可以有效减少孕穗期低温冷害对寒地粳稻产量造成的损失。

表7 孕穗期冷水胁迫下施用CaCl2, Glu and GABA 对寒地粳稻耐冷性的综合影响Table 7.Comprehensive effects of exogenous CaCl2, Glu and GABA on cold tolerance of cold-regionjaponicarice under cold water stress at booting stage.

图1 孕穗期冷水胁迫下外源物质浓度与寒地粳稻ASFV 的关系Fig.1.Relationship between exogenous substances concentration and ASFV of cold-regionjaponicarice under cold water stress.

表8 孕穗期冷水胁迫下施用不同浓度配比CGG 对寒地粳稻产量相关指标的影响Table 8.Effects of different concentrations of CGG on cold-water stress at the booting stage.

表9 ASFV 响应曲面模型方差分析Table 9.Response surface model ANOVA of ASFV.

2.2 孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度配比CGG 对寒地粳稻氮光合效率及产量形成的影响

2.2.1 孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度配比CGG对寒地粳稻氮光合效率的影响

图2 孕穗期冷水胁迫下施用外源物质对寒地粳稻产量相关指标平均隶属函数值的影响Fig.2.Effect of application of exogenous substances on ASFV of yield-related indexes of cold-regionjaponicarice under cold water stress at booting stage.

表10 孕穗期冷水胁迫下施用最适配比CGG 对寒地粳稻齐穗期氮光合效率的影响Table 10.Effects of application of the optimal ratio CGG under cold water stress at booting stage on nitrogen photosynthetic efficiency of cold-regionjaponicarice at full heading stage.

表11 孕穗期冷水胁迫施用最适浓度配比CGG 对寒地粳稻群体抽穗后干物质生产及温度生产效率方差值的影响Table 11.Effect of optimal concentration of CGG during cold-water stress at booting stage on variance of dry matter production of cold-regionjaponica rice after heading stage.

图3 孕穗期冷水胁迫施用最适浓度配比CGG 对寒地粳稻群体抽穗后干物质生产的影响Fig.3.Effect of optimal concentration of CGG during cold-water stress at booting stage on dry matter production of cold-regionjaponica rice after heading stage.

由表10 可知，与正常灌溉相比，孕穗期低温胁迫下寒地粳稻功能叶片质量、叶面积及氮光合效率的相关指标均显著下降，外源施用CGG 可显著提高齐穗期叶面积，可在一定程度上提高氮素光合效率相关指标，且品种间存在差异。与孕穗期冷水胁迫相比，施用CGG 可显著提高东农428 齐穗期叶面积指数(5.37%)及氮光合效率(4.53%)；可显著提高松粳10 单位面积叶片干物质量(2.56%)和叶面积指数(3.39%)。

2.3.2 孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度配比CGG对寒地粳稻产量形成的影响

由表11 可知，处理对寒地粳稻抽穗后干物质积累量及群体生长速率影响极显著；多因素方差分析可知，品种和处理对抽穗后干物质积累量及群体生长速率影响极显著，年份、品种和处理对抽穗后干物质积累量影响极显著。由图3 可知，与孕穗期冷水胁迫相比，施用最适浓度配比CGG 可提高寒地粳稻抽穗至成熟期干物质积累量，但其积累量仍低于正常灌溉水平，且在品种和处理间存在差异。抽穗后群体生长率变化趋势与干物质积累量基本一致。孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度配比CGG处理下东农428 群体抽穗后干物质积累量、群体生长率均高于松粳10，东农428 抽穗后干物质积累量两年平均值较松粳10 高18.73%。说明外源最适浓度配比CGG 可通过提高东农428 抽穗后光合能力及光合功能持续时间，进而提高光合物质的积累量。由表12 可知，与孕穗期冷水胁迫相比，施用最适浓度配比CGG 寒地粳稻产量及产量构成因素均有所上升，但仍低于正常灌溉水平，且品种间存在差异；施用最适浓度配比CGG 处理下东农428两年产量达8340.5 kg/hm2，松粳10 为7093.5 kg/hm2，较孕穗期冷水胁迫处理分别增加11.05%和24.47%，差异显著(表12)。说明施用最适浓度配比CGG 可以在一定程度上提高寒地粳稻产量，且对冷敏感的品种影响更为显著。

表12 孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度配比CGG 对寒地粳稻产量及产量构成因素的影响Table 12.Effect of optimal concentration of CGG during cold-water stress at booting stage on yield and yield components of cold-regionjaponicarice.

2.3.3 孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度CGG 对寒地粳稻温度利用效率的影响

由表11 可知，品种、处理对温度生产效率影响极显著，品种和处理对温度生产效率影响极显著，品种、处理和年份间互作对温度生产效率影响显著。由图4 可知，不同处理间温度生产效率差异显著，具体表现为正常灌溉＞冷水胁迫+CGG＞冷水胁迫。与孕穗期冷水胁迫相比，施用CGG 东农428和松粳10 温度生产效率平均增幅分别为5.55%和23.72%。外源CGG 对于温度生产效率差异的贡献率为8.99%。

3 讨论

研究证明逆境胁迫下外源施用 γ-氨基丁酸(GABA)[8,10,31-33]、氯化钙(CaCl2)[12-17]和谷氨酸(Glu)[18]可提高植物的耐逆性。外源施用GABA 能够提高作物抗氧化酶活性、降低活性氧(ROS)等物质的积累，改善光合能力，降低逆境胁迫对作物的伤害[7-11]；外源施用CaCl2主要是通过调节植物的氮代谢水平进而提高植物的耐逆性[12-14]，植物体内脯氨酸含量[15]和 GABA 含量及谷氨酸脱羧酶(GAD)活性[16-17]显著提高，使其耐逆性增强；外源施用Glu 可使低温胁迫下大麦幼苗中GABA含量升高，耐冷性增强[18]。本研究发现孕穗期冷水胁迫下外源施用CaCl2、Glu、GABA 可在一定程度上提高寒地粳稻产量(表5)，减轻冷水胁迫对寒地粳稻的损伤，这与前人的研究结果一致，且通过隶属函数综合分析筛选出4.5 mmol/L GABA、2.0 mg/mL Glu和2.60 mmol/L CaCl2可作为最适单剂浓度。本课题组前期研究发现苗期低温胁迫下外源施用GABA、CaCl2和Glu 最适浓度配比三种外源物质可以显著提高寒地粳稻耐冷性[20]。但关于寒地粳稻孕穗期冷水胁迫下施用GABA、CaCl2和Glu 最适浓度配比的筛选及施用最适浓度配比三种外源物质对寒地粳稻氮光合效率及产量形成调控效应鲜有报道。本研究发现三种外源物质最优浓度配施保产效果优于单独施用三种外源物质。由于逆境胁迫下Ca2+作为信号传导物质激发细胞内GAD，使其催化L-谷氨酸 (L-Glu)发生不可逆的脱羧反应形成GABA，进而使植物体内GABA 含量上升[6,34]。这说明孕穗期冷水胁迫下寒地粳稻功能叶片喷施外源CaCl2和Glu 可作为GABA 合成的信号传导物质和底物，进而促进GABA 合成，提高寒地粳稻抵御低温胁迫的能力；此外，外源施用GABA 可以在胁迫条件下诱导GABA 内源水平的变化[32,35]，进而抵御逆境胁迫对作物造成的伤害。因此，本研究基于中心组合试验结果得出三种外源物质的最适浓度配比；孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度CGG 寒地粳稻产量相关性状隶属函数平均值值最大(如表7 和图2)，可有效减少低温冷害对寒地粳稻产量造成的损失。

图4 孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度配比CGG 对寒地粳稻温度生产效率的影响Fig.4.Effect of optimal concentration of CGG during cold-water stress at booting stage on temperature production efficiency of cold-regionjaponica rice.

光合产物生产能力与叶片氮含量之间呈正相关关系[36]。氮素可通过调控叶面积指数、叶片氮含量、叶绿素含量进而调控光能利用率[37]。植株含氮量下降会导致叶绿素含量及蛋白质含量降低，进而影响光合产物生产[38]。研究发现，低温胁迫影响水稻叶片的生长[2,39-41]，表现为植株叶面积降低[42,43]、叶片变得窄而厚[44]；此外，低温胁迫抑制水稻对氮素的吸收，会造成植株氮素供应不足[2]；而外源施用GABA[9,45,46]、CaCl2[14]可改善光合系统进而使作物积累更多的光合产物。本研究发现，与孕穗期低温胁迫相比，施用外源物质CGG 不仅可以促进叶片生长，使其叶面积指数显著提高(东农428，5.37%；松粳10，3.39%)，还可提高功能叶片氮素浓度(东农428，2.46%；松粳10，3.00%)，这将有利于寒地粳稻光合产物生产及产量形成。

叶片氮光合效率是衡量叶片氮含量与光合强度、光合产物积累间关系的重要指标[47]。外界环境条件影响水稻叶片氮光合效率[48]。本研究发现耐冷性不同的品种氮光合效率对外源CGG 的响应机制存在差异。与孕穗期冷水胁迫相比，施用CGG 可显著提高东农428 齐穗期氮光合效率(4.53%)；可对松粳10 氮光合效率效应不显著。由于当植物的氮供应不足时，C3作物更倾向于通过减少叶片伸展来确保更多的氮素用于维持相对较高的叶绿素含量[49]。这表明孕穗期冷水胁迫下施用CGG 主要通过调节松粳10 叶片生长进而使其叶片氮素浓度及单位面积氮素含量维持在相对稳定的水平，达到保产目的；但施用外源CGG 后东农428 单位叶面积氮素含量虽稍有下降，但是其叶面积指数及净光合速率均显著上升，进而促进光合作用有利于产量形成，这可能是孕穗期冷水胁迫下施用CGG 东农428产量高于松粳10 的主要原因。

研究证实抽穗至成熟期干物质积累量与产量呈显著或极显著正相关[50-54]。因此，提高孕穗期冷水胁迫下寒地粳稻生育后期(抽穗至成熟期)干物质积累量，对寒地粳稻产量形成至关重要。本研究结果表明，孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度配比CGG处理下东农428群体抽穗后干物质积累量、群体生长率均高于松粳10。说明外源最适浓度配比CGG可通过提高东农428抽穗后光合能力及光合功能持续时间，进而提高光合物质的积累量。这表明孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度CGG后东农428群体干物质积累动态较为稳定，是产量形成的坚实物质基础，这与前人的研究结果基本一致[52,54]。同时，孕穗期冷水胁迫下施用最适浓度CGG后寒地粳稻抽穗后群体生长率变化趋势与干物质积累量基本一致，且东农428产量8340.5 kg/hm2，松粳10为7093.5 kg/hm2，较孕穗期冷水胁迫处理分别增加11.05%和24.47%，差异显著，进一步说明孕穗期冷水胁迫下外源CGG对耐冷性弱的品种产量影响较大(图 3、表10和表11)。

当前造成产量存在差距的原因，并不是光、温资源不足，而是资源利用效率低[55]。与孕穗期冷水胁迫相比，施用CGG 东农428(5.55%)和松粳10(23.72%)温度生产效率显著提高，外源CGG对于温度生产效率差异的贡献率为8.99%。这说明制定有效抵御低温冷害的栽培技术措施可以缩减低温冷害对水稻产量造成的损失[29]。

4 结论

外源施用CGG 最适浓度配比为1.87 mmol/L CaCl2、2.76 mg/mL Glu、4.40 mmol/L GABA，隶属函数平均值最大(0.932)。与正常灌溉相比，孕穗期低温胁迫下寒地粳稻功能氮光合效率下降；与孕穗期冷水胁迫相比，外源施用最适浓度配比CGG 可促进寒地粳稻叶片生长，提高功能叶片氮素浓度及齐穗期氮光合效率进而有利于光合产物的积累，最终减轻孕穗期冷水胁迫下寒地粳稻产量损失，提高孕穗期冷水胁迫下寒地粳稻温度生产效率。