於慧佳 董红阳 孙立新

（沈阳药科大学药学院， 辽宁本溪117004）

尪（音同“王” ） 痹片由地黄、熟地黄、续断、附子（黑顺片）、独活、骨碎补、桂枝、淫羊藿、防风、威灵仙、皂角刺、羊骨、白芍、狗脊 （制）、知母、伸筋草、红花17 味药材组成，方中续断、骨碎补、狗脊、羊骨、附子、淫羊藿、地黄、熟地黄共为君药，桂枝、独活、防风、威灵仙共为臣药，白芍、知母、伸筋草、皂角刺、红花共为佐药，可治疗肝肾不足、风湿阻络所致的尪痹，症见肌肉、关节疼痛等，以及类风湿性关节炎见有上述证候者［1］，它具有镇痛抗炎等药理作用［2⁃6］，对多种风湿骨病行之有效［7⁃15］。在2015 年版《中国药典》 一部中，尪痹片质量控制仅规定了TLC 定性鉴别和淫羊藿苷含有量测定，无法全面控制该制剂质量。

中药指纹图谱能反映中药可测成分的整体质量信息，整体评价产品质量的稳定性和一致性［16］。因此，本实验建立尪痹片HPLC 指纹图谱，并通过主成分分析评价该制剂质量。

1 材料

1.1 仪器 LC⁃20AT 型高效液相色谱仪（配置SPD⁃M20A型二极管阵列检测器、CBM⁃20A 型控制器、Labsolution 色谱工作站，日本岛津公司）；JF1004 型电子天平（万分之一，余姚市金诺天平仪器有限公司）；TG332A 型微量分析天平（十万分之一，湘仪天平仪器厂）；KQ5200B 型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 尪痹片［辽宁好护士药业（集团） 有限公司，批号161007、161116、160710、161018、161216、170209、161209、160315、151208、160605，编号S1～S10，0.5 g／片］。原儿茶酸（批号110809⁃201205）、原儿茶醛（批号110810⁃201608）、芍药苷（批号110736⁃201741）、淫羊藿苷（批号110737⁃201516） 对照品均购自中国食品药品检定研究院；马钱苷酸（批号M⁃008⁃180102） 对照品购自成都瑞芬思生物科技有限公司。乙酸、甲醇、乙腈为色谱纯（百灵威科技有限公司）；纯化水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.1%乙酸（B），梯度洗脱（0～12 min，5%～10% A；12～16 min，10%A；16～18 min，10%～12%A；18～33 min，12%～14%A；33～40 min，14%～18% A；40～60 min，18%～25% A；60～80 min，25%～40%A；80～90 min，40%～80%A；90～95 min，80%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长235 nm；进样量5 μL。在此条件下，理论塔板数按各成分计均不低于5 000，各成分色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.2。

2.2 供试品溶液制备 将片剂去包衣后研细，精密称取粉末1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20 mL 25%甲醇，密塞，称定质量，超声（250 W、33 kHz） 提取30 min，放冷，25%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，25%甲醇制成分别含原儿茶酸103.5 μg／mL、马钱苷酸398.9 μg／mL、原儿茶醛47.9 μg／mL、芍药苷1 910.2 μg／mL、淫羊藿苷179.0 μg／mL 的溶液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一份供试品溶液 （批号161007），在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，以6 号峰（马钱苷酸） 为参照测定各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD，测得两者分别为0.16%～1.2%、0.83%～1.9%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批样品 （批号161007） 6份，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以6 号峰（马钱苷酸） 为参照测定各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD，测得两者分别为0.14%～0.83%、0.97%～1.9%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液 （批号161007），于0、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，以6 号峰（马钱苷酸） 为参照测定各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD，测得两者分别为0.13%～1.5%、0.69%～1.8%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5 指纹图谱生成 取10 批片剂，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，建立指纹图谱，结果见图1，再采用中药指纹图谱相似度评价系统（2012 版） 生成对照指纹图谱，发现有26 个共有峰，见图2，其中6 号峰（马钱苷酸） 分离度较好，峰面积较稳定，故选择其作为参照峰（S）。经与对照品比对后，峰5、6、7、14、22 分别为原儿茶酸、马钱苷酸、原儿茶醛、芍药苷、淫羊藿苷。

图1 10 批样品HPLC 指纹图谱

图2 对照指纹图谱

2.6 指纹图谱评价

2.6.1 相似度分析 通过中药指纹图谱相似度评价系统（2012 版），对10 批样品进行相似度评价，S1～S10 相似度分别为 0.980、0.987、0.981、0.990、0.991、0.970、0.979、0.977、0.876、0.983，可知各批样品质量比较稳定。

2.6.2 主成分分析 通过SPSS 22.0 软件，以26 个共有峰面积标准化后的数值为变量，计算主成分特征值、累积贡献率，结果见表1。由此可知，前3 个主成分的累积贡献率为65.651%，而前5 个为86.042%，由于变量多，故只取前3 个，可代表指纹图谱共有峰的大部分信息。

表1 主成分特征值及贡献率

将3 个主成分进行排序，结果见图3。由此可知，19、14、26、16、25、7、11、3 号峰对主成分1 有显著贡献（依次降低），24、23、13、9 号峰对主成分2 有显著贡献，6、10 号峰对主成分3 有显著贡献，即不同批次样品的质量差异主要体现在这14 种成分含有量上。其中，14 号峰（芍药苷）、7 号峰（原儿茶醛）、6 号峰（马钱苷酸） 为重要参数，并且分别为佐药白芍、君药狗脊、君药续断的特征性成分。

图3 3 个主成分排序坐标图

对主成分载荷值进行计算，得到线性模型，代入各相关数据后得到主成分得分及综合得分，结果见图4。由此可知，主成分1 中得分较高的是S2、S4、S6，主成分2 中得分较高的是S5、S7，主成分3 中得分较高的是S3、S4，综合得分排名依次为S4＞S2＞S5＞S3＞S6＞S1＞S7＞S8＞S9＞S10，其中生产日期较近的批次主成分得分较高，而生产日期较远的相对较低，即前者质量更好。另外，不同批号样品中的药材产地、来源有一定差异，也导致其质量有所不同。

图4 主成分得分、综合得分排序坐标图

3 讨论

本实验筛选提取溶剂时考察了水、甲醇（25%、50%、75%、100%）、乙醇 （25%、50%、75%、100%），发现25%甲醇提取效果最佳，各成分提取均较充分；考察加热、超声提取，发现两者提取效果相当，故选择更简单易行的后者；考察了提取时间、料液比，发现两者分别为30 min、1 ∶20 时提取效率最高；考察了不同流动相比例、色谱柱、体积流量、柱温，确定“2.1” 项下色谱条件。

然后，建立了10 批尪痹片的HPLC 指纹图谱，发现有9 批相似度大于0.97，表明其质量比较一致；样品S9 相似度为0.876，而它为2015 年生产 （有效期至2018 年11月），可能主要是存储时间较长导致质量有所差异。主成分分析采用降维模式，将反映HPLC 指纹图谱的多维特征参数用3 个主成分表示，可为尪痹片质量评价提供参考。