邓雪琪 管小军 黄娜娜 李 俊

（1.云南中医药大学， 云南昆明650500； 2.云南昊辰健康有限公司， 云南昆明650500； 3.云南省民族特色养生理论与健康产品工程实验室， 云南昆明650500）

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.） Diels 的干燥根，主产于甘肃，在云南、四川、湖北等省也有种植，目前市场上除“岷归”外，大多销售的为“云当归”［1］。当归临床应用广泛，具有补气止血、行血、养血、和血之功［2］，其化学成分主要包括有机酸类、苯酞类、香豆素类等，还有一些氨基酸类［3⁃4］。其中阿魏酸是当归有机酸的主要活性成分，具有抗炎、抗老年痴呆、补血活血等多种功效，也是2015 年版《中国药典》 含有量测定项下的规定成分［5⁃6］。绿原酸具有保肝、利胆、抗肿瘤、抗病毒等广泛的药理活性［7］。苯酞类化合物包括藁本内酯、洋川芎内酯A、洋川芎内酯Ⅰ、丁烯基苯酞等，是当归挥发油的主要成分，其中藁本内酯的含有量最高，该类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抑制血管生成、消炎解痛等多种药理作用［8⁃11］。香豆素类化合物包括蛇床子素、补骨脂素、异欧前胡素、香柑内酯、欧前胡素等［4，12］，该类化合物具有抗肿瘤、抗高血压、抗心肌缺血、抗炎、止痛等多种药理活性［13⁃14］。色氨酸是一种人体必需的氨基酸，人体自身无法合成［15］。近年来，随着当归市场需求量的增加，由于云当归的优良品质，也逐渐成为了当归市场的重要组成部分，种植面积在不断扩大。为了解不同当归药材的品质，本研究建立HPLC 法检测不同当归中的指标性成分，以期为其进行更加全面的质量评价提供参考。

1 材料

LC⁃2030 高效液相色谱仪、UV⁃2450 紫外分光光度计（日本Shimadzu 公司）；1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；AB265⁃S 电子分析天平（十万分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；HH⁃S4数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）；Ultimate C18色谱柱（月旭材料科技有限公司）；Li⁃chroshper C18色谱柱（汉邦科技有限公司）。

色氨酸 （140686⁃201303）、绿原酸 （110753⁃201415）、阿魏酸 （110773⁃201614）、欧前胡素（110825⁃201616） 购自中国食品药品检定研究院；洋川芎内酯Ⅰ （P02F9F54165）、洋川芎内酯H（P02F9F54165） 购自上海源叶生物科技有限公司；丁烯基苯酞（CHB161018） 购自成都克洛玛生物科技有限公司；Z⁃藁本内酯（MUST⁃17041012） 购自成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈为色谱纯，其余为分析纯。

收集传统采收期当归药材共21 批，分别于云南维西、丽江、大理、瑞丽、甘肃实地采收，以及收购于各药材公司，经云南中医药大学陈绍田副教授鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根。信息见表1。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z⁃藁本内酯、丁烯基苯酞对照品适量，加甲醇制备成每1 mL 含色氨酸50 μg、绿原酸70 μg、阿魏酸55 μg、洋川芎内酯Ⅰ16 μg、洋川芎内酯H 5 μg、欧前胡素190 μg、Z⁃藁本内酯500 μg、丁烯基苯酞50 μg 的溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备 取样品粉末（过3 号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液过滤，取续滤液，即得。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2.3 色谱条件 Ultimate C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A） -0.085%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A；10～15 min，10%～12%A；15～20 min，12%～22%A；20～56 min，22%～62%A；56～60 min，62%～70%A；60～65 min，70%～10%A）；检测波长280 nm；柱温30 ℃。理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于5 000。结果见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 精密取各对照品适量，加甲醇溶解，配制成每1 mL 含色氨酸84.40 μg、绿原酸120.40 μg、阿魏酸92.00 μg、洋川芎内酯Ⅰ25.30 μg、洋川芎内酯H8.72 μg、欧前胡素321.60 μg、Z⁃藁本内酯880.00 μg、丁烯基苯酞82.26 μg 的混合对照品贮备液，分别精密吸取上述混合对照品贮备液，用甲醇稀释成不同浓度的混合对照品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样，以各对照品峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X） 进行回归，结果见表2，表明各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 分别精密吸取“2.1” 项下混合对照品溶液，在“2.3” 项色谱条件下连续进样6 次，每次10 μL，测得色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z⁃藁本内酯、丁烯基苯酞峰面积RSD 分别为0.76%、0.43%、0.80%、1.50%、1.63%、0.62%、0.48%、2.04%。表明仪器精密度好。

2.6 重复性试验 精密称取当归药材粉末（批号20180401），按“2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下连续进样，测得色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z⁃藁本内酯、丁烯基苯酞含有量RSD 分别为1.42%、1.70%、1.18%、1.84%、1.99%、1.76%、1.45%、1.92%。表明该方法重复性好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下，分别于制备后0、2、4、8、12 h 进样10 μL，测得色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z⁃藁本内酯、丁烯基苯酞峰面积RSD 分别为1.68%、1.58%、1.63%、1.75%、2.08%、1.10%、0.98%、1.76%。表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取当归药材粉末（过3 号筛） 6 份，每份约0.5 g，置250 mL 锥形瓶中，加入各成分含有量已知的混合对照品贮备液2 mL，按“2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下进样，计算加样回收率。各成分平均回收率 97.60%～ 101.22%，RSD 0.89%～2.51%。

2.9 样品含有量测定 取不同产地的当归药材粉末（过3 号筛） 约1.0 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项色谱条件下测定8 种成分的峰面积，以外标法计算含有量，结果见表3。2.10 聚类分析 以21 批样品中8 种有效成分含有量数值为变量，采用SPSS 19.0 软件对样品进行系统聚类分析，利用欧氏距离作为样品的测度。纵坐标为样品编号，结果见图2，当聚类标定距离为25 时，21 批样品聚为两大类，样品S1、S3 聚为第一类，其余样品聚为第二类。当聚类重新标定距离为5 时，样品S7、S9、S12 聚为第二小类，样品S4～S6、S18、S20 聚为第三小类，样品S2、S8～S11、S13～S17、S21 聚为第四小类。

表3 各成分含有量测定结果（%）Tab.3 Results of content determination of various constituents （%）

图2 21 批样品聚类树状图Fig.2 Dendrogram of twenty⁃one batches of samples

结合含有量结果发现，第一类样品是8 种成分总含有量最低的一批，也是Z⁃藁本内酯含有量最低的一批，第二类样品是总含有量最高的一批，也是Z⁃藁本内酯和阿魏酸含有量最高的一批，而其他成分的含有量对最终的总含有量结果影响不显著，由此可见，Z⁃藁本内酯和阿魏酸含有量对当归药材的质量具有显著影响。Z⁃藁本内酯含有量高的情况下，阿魏酸以及其他的几个苯酞类化合物洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、丁烯基苯酞的含有量一般也较高，所以，为了保证当归药材的质量，必须全面对阿魏酸和Z藁本内酯2 种主要成分同时进行控制，再辅以其他成分，对当归药材质量进行综合评价。结合聚类分析和含有量测定结果来看，云南维西所产2 批、云南瑞丽所产1 批当归为活性成分总含有量最高，表明云当归质量亦佳，当欧式距离为25 时，云南所产的当归共有18 批与甘肃当归聚为一类，可见，云南所产当归药材与甘肃所产当归质量相似。

3 讨论

3.1 波长选择 对8 种成分进行全波长扫描结果初选260、280 nm 为因素进行考察。结果表明，相比于280 nm 波长，260 nm 波长下色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H 的峰面积吸收值均有不同程度的减小，而欧前胡素和丁烯基苯酞峰面积吸收值260 nm 却比280 nm 高的多。由于绿原酸、洋川芎内酯H 等成分含有量较低，且阿魏酸作为主要检测指标，在260 nm 波长下峰面积吸收值减小近一半，而丁烯基苯酞和欧前胡素虽然在280 nm 波长下减小较多，但是由于这2 种成分含有量较高，在280 nm 下也能被稳定检测，最终选用280 nm 为检测波长。

3.2 提取溶剂选择 选定70% 甲醇、80% 甲醇、100%甲醇3 种溶剂，超声和回流提取2 种方式进行考察。结果显示70%、80%、100%甲醇为溶剂，均能提取到阿魏酸松柏酯，甲醇比例越高，提取到的阿魏酸松柏酯含有量越高。但实验过程中发现，随着时间延长，阿魏酸松柏酯含有量会逐渐减少，阿魏酸松柏酯在甲醇溶液中不稳定，且受热遇光也极易分解成阿魏酸和松柏酯［16⁃17］。所以采用70%甲醇。

4 结果与讨论

本研究以当归中色氨酸、绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、欧前胡素、Z⁃藁本内酯、丁烯基苯酞为指标，建立HPLC 法测定其含有量，选取了云南维西、丽江、瑞丽、大理，甘肃等产地不同批次样品进行检测，由8 种成分的含有量可知不同产地药材、同一产地不同批次药材有效成分含有量各不相同，如有些批号药材就能检测到绿原酸，有些药材欧前胡素含有量较高，而主要的成分阿魏酸、Z⁃藁本内酯含有量并无显著性差异，表明云南出产的云当归与传统道地产区的甘肃当归质量相似。

本研究建立HPLC 法同时对当归中8 种成分进行含有量测定，该方法可用于当归药材质量的全面评价。当归化学成分复杂，当中包括很多热不稳定、见光易分解、易水解的化学成分，其中以阿魏酸松柏酯、Z⁃藁本内酯为代表，作为当归药材中含有量较高且有显著药理活性的成分，无疑是评价当归药材品质的重要指标。阿魏酸松柏酯无论在药材中，还是单独作为纯品，室温条件下都极易发生水解，Z⁃藁本内酯在当归药材中可稳定存在，而它的纯品在室温条件下易降解，生成多种异构化产物［18］。怎样解决对照品的纯度及稳定性，并将其稳定用于当归药材的含有量测定还有待进一步研究。