李玲玲

(重庆工贸职业技术学院 生物化学工程系，重庆 涪陵 408000)

0 引言

挥发油类又称精油，是一类具有挥发性可随水蒸气蒸馏出来的油状液体，大部分具有香气。青蒿精油含有丰富的单萜和倍半萜类，是一种具有药用价值的副产品[1]。现代研究证明青蒿挥发油具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗炎、驱蚊、杀虫、抗氧化等活性[2]。主要用途有治疗痤疮、抑制流感病毒、消炎、抗溃疡、局部刺激和强心、解热、止咳、祛痰、平喘和镇痛，并能作为保健食品[3]，还可用于研制驱蚊贴[4]。

挥发油的提取方法主要有4种：蒸馏法、溶剂提取法、压榨法、二氧化碳超临界流体提取法，其中蒸馏法又分为水蒸气蒸馏法和直接蒸馏法[5]。影响青蒿挥发油提取含量的因素有提取方法、生长采收期、贮存期、产地、部位等[6]。李春红等[7]测定了5月至10月青蒿挥发油的含量，结果发现青蒿挥发油的含量随生长期的延长逐渐增高，9月份盛花期含量最高。青蒿不同部位挥发油收率花>叶>茎、根，甘肃庆阳产青蒿茎和叶挥发油收率分别为2.8%和9.7%[6,8]。Yinta Li等[9]采用二氧化碳超临界流体提取青蒿精油，原油收率达到了11.17%。

本研究以重庆涪陵地区9～10月青蒿植株的叶和花作为材料，采用水蒸气蒸馏法提取其中的挥发油，测定挥发油的抑菌活性。为青蒿挥发油在抑菌领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：重庆市涪陵地区9～10月青蒿植株的叶和花。

抑菌试验指示菌：细菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 10384、大肠埃希菌(Escherichiacoli)CICC 23657、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)CICC 10275，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。真菌：黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2487、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC 33032均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯蔗糖琼脂培养基。

试剂：无水乙醚(分析纯、成都市科隆化学品有限公司)。

1.2 仪器与设备

轻油挥发油测定器(安徽科腾实验设备有限公司)、CL-2型恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)、智能MHP-250型霉菌培养箱(上海三发科学仪器有限公司)、DNP-9272A型电热恒温培养箱(上海将任实验设备有限公司)、LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)、SW-CJ-1FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 材料的准备

将采集的青蒿除去残茎及无用部位，将留下的叶子和花蕾洗净，滤干水分。

1.3.2 精油的提取

准确称取一定量的青蒿叶和花，室温下置蒸馏水中浸泡一段时间后，参照2015年版《中国药典》(四部)挥发油测定法(甲法)提取青蒿精油[10]。

精油的得率按照下式计算：精油得率=挥发油体积/青蒿质量×100%

(1)

1.4 单因素实验

考察浸泡时间、料液比、蒸馏时间3个因素对青蒿精油提取量的影响，每个因素取3个水平。

1.5 正交试验

根据单因素试验结果，以浸泡时间、料液比和蒸馏时间为自变量，以精油得率为评价指标，设计了3因素3水平正交试验，探讨精油最佳提取工艺。

1.6 抑菌试验

以5种代表性的指示菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母来检测青蒿精油的抑菌活性，这5种指示菌中既有革兰氏阳性菌，也有革兰氏阴性菌；既有细菌，也有真菌。

1.6.1 供试菌液的制备

利用牛肉膏蛋白胨斜面活化3 种供试细菌菌株，利用PDA培养基活化酵母和黑曲霉，收集对数生长期的菌于生理盐水中(黑曲霉收集的是孢子)，制成含量约为1×107cfu/mL的供试菌液，备用[11]。

1.6.2 抑菌圈直径的测定

采用滤纸片扩散法测定挥发油的抑菌效果。滤纸片浸透挥发油：挥发油与无水乙醚按1∶1体积比混匀。用打孔器将滤纸制作成直径为6 mm的滤纸片，灭菌后烘干，浸泡于挥发油溶液中30 min，使之充分吸收，沥干。

接种、涂布指示菌：用移液枪分别吸取100 μL制备好的供试菌液，加在相应的平板上(3种指示细菌加在牛肉膏蛋白胨平板上，真菌加在PDA平板上)，用涂布棒涂布均匀。

贴滤纸片：用镊子夹取3张滤纸片，呈“品”字形贴于相应的加有指示菌的平板上。另外放1片只浸有乙醚的滤纸片作为空白对照，每组实验重复2次[12]。

培养：置于恒温培养箱中培养(细菌在37 ℃下培养24 h，真菌在28 ℃下培养48～72 h)，测定抑菌圈直径。

1.6.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定

采用倍比稀释法测定挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母的MIC，进一步检测青蒿精油的抑菌程度。

液体培养基倍比稀释挥发油：将灭菌后的牛肉膏蛋白胨液体培养基(测细菌MIC)或马铃薯蔗糖液体培养基(测真菌MIC)分装于7支试管中，第1管1.2 mL，其余各管1 mL。用移液枪吸取0.8 mL的青蒿精油于第1支试管内，盖上试管塞，混匀后吸出1 mL至第2支试管中，混匀再吸取1mL至第3支试管中，以此类推，直至第7管，从第7管中吸出1 mL弃去。稀释后，第1管至第7管中挥发油的体积分数依次为：400 μL/mL、200 μL/mL、100 μL/mL、50 μL/mL、25 μL/mL、12.5 μL/mL、6.25 μL/mL。同时设置对照，对照一：在1 mL培养基中只加入30 μL青蒿精油；对照二：在含 1 mL培养基的试管中，只加入30 μL指示菌液。

接种指示菌液：在含不同体积分数青蒿精油的试管(1～7号管)及对照二的试管中，分别加入1.6.1制备的供试菌液30 μL，充分混匀。(此时1～7号管中挥发油的体积分数分别为：388.3 μL/mL、194.2 μL/mL、97.1 μL/mL、48.5 μL/mL、24.3 μL/mL、12.2 μL/mL、6.1 μL/mL)

培养：将上述各试管放入摇床振荡培养，接种了3种指示细菌的试管在36 ℃、180 r/min的条件下培养24 h；接种了酿酒酵母和黑曲霉的试管在28 ℃、150 r/min的条件下分别培养48 h和72 h。

检查：取出试管，逐个检查各试管的浑浊度。对照一完全透明、对照二浑浊，说明试验结果有效。其它各试管与对照一透明度一样，表明指示菌的生长被抑制；浑浊则说明有指示菌生长。取完全无指示菌生长的最低挥发油浓度为最低抑菌浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 青蒿精油的性状

青蒿精油为淡黄色的透明液体，有特异气味，随蒸馏时间延长，黄色程度会逐渐加深。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对青蒿精油提取的影响

称取粉碎的青蒿叶30 g，置于500 mL圆底烧瓶中，固定蒸馏时间为4 h，浸泡时间为0 h，分别以料液比1∶7、1∶8、1∶9(质量体积比)进行精油的提取，研究料液比对青蒿叶和花中精油提取的影响，确定最佳料液比。结果见表1。

表1 料液比对青蒿精油提取的影响Tab.1 Effect of ratio of material to liquid on extraction of Artemisia annua essential oil

由表1可以看出，随着料液比的增加，精油得率先增加，后减少。这可能是因为水分过少(料液比为1∶7)时不能充分浸润物料，导致提取不完全；水分过多时(料液比1∶9)，精油在水中的溶解度增加，导致提取的精油减少。因此最佳料液比为1∶8。

2.2.2 蒸馏时间对青蒿精油提取的影响

称取粉碎的青蒿叶30 g，置于500 mL圆底烧瓶中，固定浸泡时间为0 h，料液比为1∶8，分别蒸馏1 h、2 h、3 h进行精油的提取，研究蒸馏时间对青蒿叶和花中精油提取的影响，确定最佳蒸馏时间。结果见表2。

表2 蒸馏时间对青蒿精油提取的影响Tab.2 Effect of distillation time on extraction of Artemisia annua essential oil

由表2可以看出，1～2 h随着蒸馏时间的增加，精油得率逐渐增加；2～3 h随着蒸馏时间的增加，精油得率降低。这可能是由于2 h时精油已经提取完全，继续延长蒸馏时间，由于精油的易挥发性，导致提取出的精油挥发损失了一部分，从而导致精油的得率下降。另外随着蒸馏时间的延长，青蒿精油的颜色由淡黄色逐渐变深。因此最佳的蒸馏时间为2 h。

2.2.3 浸泡时间对青蒿精油提取的影响

称取粉碎的青蒿叶30 g，置于500 mL圆底烧瓶中，固定蒸馏时间为4 h，料液比1∶8，分别以浸泡时间为0 h、1.5 h、3 h进行精油的提取，研究浸泡时间对青蒿叶和花中精油提取的影响，确定最佳浸泡时间。结果表3。

表3 浸泡时间对青蒿精油提取的影响Tab.3 Effect of soaking time on extraction of Artemisia annua essential oil

由表3可以看出，0～1.5 h随着浸泡时间的增加，青蒿精油的得率逐渐增加，1.5～3 h，随着浸泡时间的增加，精油得率不再变化。因此最佳浸泡时间为1.5 h。

2.3 正交试验结果

根据单因素实验的结果，每一单因素分别选取3个水平进行正交试验，正交试验设计见表4。分别取青蒿叶和花30 g，按照表5中的1～9号处理进行青蒿精油的提取，以得率为指标，进行直观分析，结果见表5。用SPSS Statistics 17.0软件对试验结果进行方差分析，结果见表6。

表4 正交试验因素水平表Tab.4 Level table of factors for orthogonal test

表5 正交试验结果Tab.5 Orthogonal test results

表6 提取工艺对青蒿精油得率影响的方差分析Tab.6 Variance analysis of influence of extraction process on the yield of Artemisia annua essential oil

由表6可以看出，影响青蒿精油得率的主次顺序为A>B>C，即浸泡时间>蒸馏时间>料液比。青蒿精油的最佳提取工艺条件为A2B3C2，即浸泡时间1.5 h，蒸馏时间为3 h，料液比为1∶8。由表6可以看出，各因素的水平变化对青蒿精油得率均无显著影响。

2.4 青蒿精油对指示菌的抑菌效果

通过滤纸片法测定青蒿精油(体积浓度为500 μL/mL)对5种指示菌的抑菌效果，结果表明青蒿精油对5种指示菌均有一定的抑菌效果，结果见图1和表7。

表7 青蒿精油对5种指示菌的抑菌圈大小Tab.7 Antimicrobial circle size of Artemisia annua essential oil to five indicators

注：a)金黄色葡萄球菌；b)大肠埃希菌；c)枯草芽孢杆菌；d)黑曲霉；e)酿酒酵母。图1 青蒿精油对5种指示菌的抑菌效果Fig.1 Antimicrobial effect of Artemisia annua essential oil on five indicatorsNote:a)Staphylococcus aureus;b)Escherichia coli;c)Bacillus subtilis;d)Aspergillus niger;e)Saccharomyces cerevisiae

采用液体稀释法测定青蒿精油对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母的MIC，结果见表8。

表8 青蒿精油对5种指示菌的MIC测定结果Tab.8 MIC determination of Artemisia annua essential oil for five indicators

从表8中可以看出，青蒿精油对细菌中的金黄色葡萄球菌抑菌效果最好，MIC为48.5 μL/mL。对真菌中的酿酒酵母抑菌效果最好，MIC为48.5 μL/mL。

3 讨论与结论

考虑环境污染及生产实际等多方面因素对试验造成的影响，本研究选择水作为提取溶剂。选择挥发油测定器作为收集器，由于水的密度大于青蒿的精油的密度，提取中水相位于馏出液的下层。在测定最低抑菌浓度时，比较了滤纸片法和液体培养基倍比稀释挥发油法的测定效果，发现液体培养基倍比稀释法测定最低抑菌浓度的效果更好，通过液体培养基是否浑浊更容易判断挥发油的抑菌程度。

本研究得到了青蒿叶和花蕾中精油提取的最佳工艺：浸泡时间为1.5 h，蒸馏时间为3 h，料液比为1∶8。提取出的青蒿精油对5种指示菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母)均有一定的抑菌活性，其中对金黄色葡萄球菌和酿酒酵母的抑菌效果最好，MIC均为48.5 μL/mL。