承 晨，李 莉

常州市食品药品监督检验中心，常州213000

代代花，又名枳壳花、酸橙花、香橼花，为芸香科植物代代花Citrus aurantium L.var.amara Engl.的干燥花蕾，是药食同源之品。其成熟果呈橙红色，留于树上至次年夏变为污绿色，状如回生，故其果又名回青橙、回春橙。“代代”即谓其可回生续代。5～6 月花未开放时分批采摘，及时干燥。以完整、色黄白、香气浓者为佳。主产于江苏、浙江等省。味甘、微苦，平，归肝、胃经。具有理气、宽胸、开胃的作用，主要用于胸脘胀闷、恶心呕吐、食欲不振[1-3]。

代代花中含有丰富的挥发油和柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、构椽皮素等黄酮类及N-甲基酪胺、辛弗林等生物碱成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、促进胃肠蠕动等药理作用[4-6]。除有文献报道对其干花的挥发油进行过研究外，而对黄酮类、生物碱成分的研究也仅局限于其果实枳壳[7，8]。为完善代代花的含量分析，保障药材质量，本文建立了高效液相色谱法同时测定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的含量。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Waters2695 高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）及Waters Empower 色谱工作站（美国沃特世公司）；XP105DR 十万分之一电子天平（美国Mettler 公司）。

1.2 药品与试剂

5 批代代花购于市场，分别产自徐州、常州、苏州、南通，均经江苏省炮制规范修订专家组（中国药科大学余伯阳教授、中山植物园徐增莱教授、江苏省中医院朱育凤主任）鉴定确认。

柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林对照品（分别为： 批号110722-201613，纯度94.3%；110721-201310，纯度96.1%；111857-201102，纯度99.6%；110727-201608，纯度99.9%）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈为色谱纯；冰醋酸、十二烷基硫酸钠为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4.0 μm）；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；DAD 检测器，进样量10 μL。流动相A 为乙腈，流动相B 为20%乙腈水溶液（含0.08%十二烷基硫酸钠的2.4%冰醋酸），梯度洗脱（0～15 min，0%～10%A；15～20 min，10%～60%A；20～25 min，60%～0%A）。检测波长：柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷为283 nm，辛弗林为275 nm。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、辛弗林对照品适量，置于同一100mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为1.007、0.1049、2.940、0.1003mg·mL-1的对照品贮备液。分别精密量取对照品储备液5mL，置50mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。每1 mL 分别含柚皮苷0.1007mg、橙皮苷0.01049mg、新橙皮苷0.2940mg、辛弗林0.01003mg。冷藏，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取代代花细粉0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称重，加热回流1 h，放冷，加入50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取滤液即得。

2.4 系统适用性与专属性

取混合对照品溶液、供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，结果见图1。

图1 高效液相色谱图

（A）混合对照品色谱图；（B）供试品色谱图；（C）空白溶剂色谱图1.柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷；4.辛弗林

由图1 可知，4 种成分色谱峰分离度良好（分离度>1.5），且均可通过DAD 纯度检测。方法专属性良好。

2.5 线性与范围

分别精密吸取“2.2”对照品贮备液1 mL 至2、5、10、20、50、100、200 mL 量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，按“2.1”色谱条件进样，记录峰面积，以峰面积值（Y）-进样浓度（X，mg·mL-1）进行线性回归（n=8），得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的回归方程（相对偏差、线性范围）分别为：Y=1.580×107X-2.771×104（r=1.000 0，5.035～1007 μg·mL-1）；Y=1.728×107X-978.1 （r=1.0000，0.5250～104.9μg·mL-1）；Y=1.852×107X-5.832×104（r=1.000 0，14.70～2940 μg·mL-1）；Y=4.025×106X-196.8 （r=0.999 8，0.502 0～100.3 μg·mL-1）。

2.6 定量限考察

将对照品储备液用50%甲醇进行多次等倍稀释，信噪比S/N 为10 时，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林最低定量限分别为0.5035、0.5512、0.5250、0.502 μg·mL-1。

2.7 进样精密度试验

精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液10 μL，按“2.1”色谱条件测定，重复进样6 次，记录峰面积。结果显示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的峰面积RSD 值分别为0.2%、0.2%、0.1%、0.2%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取1 批代代花（产地：苏州，批号151014）6 份，按“2.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液及供试品溶液10 μL，按“2.1”色谱条件测定，用外标法测定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的含量。结果显示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林的RSD 值分别为0.5%、0.7%、0.6%、0.7%，表明方法的重复性良好。

2.9 稳定性试验

取1 批代代花（产地：苏州，批号151014），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、12、24、36、48 h 按“2.1”项下色谱条件取10 μL 进样，测定各成分的峰面积。结果显示，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林峰面积的RSD 值分别为0.3%、0.5%、0.2%、0.5%，表明供试品溶液在48 h 内稳定。

2.10 加样回收率试验

取同一批已知含量的代代花（产地：苏州，批号151014）6 份，每份精密称取50 mg，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密加入柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林浓度分别为50.35、10.49、147、10.03 μg·mL-1的混合对照品溶液25 mL 及50%甲醇25 mL，按“2.1”色谱条件进样，分别测定其峰面积，用外标法计算加样回收率和RSD，结果见表1。

2.11 样品测定

取5 批代代花，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液及供试品溶液10 μL，按“2.1”色谱条件测定，用外标法分别计算含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 代代花属芸香科植物酸橙的变种，参考《中国药典》与枳实同属，提取物代表成分为黄酮类的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和生物碱类的辛弗林，因此本研究同时使用上述对照品为指标，对代代花的质量进行了评价。通过对水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等溶剂的考察，发现使用50%的甲醇作为溶剂，样品的提取效率高，在对照品色谱图中，色谱峰峰形对称，理论塔板数高，分离效果好。通过考察超声、回流等不同提取方法及提取时间，发现加入50%甲醇50 mL，加热回流1 h，效果最佳，基本可以提取充分，且加样回收试验也验证了方法的准确性。

表1 加样回收率试验结果（n=6）

表2 样品含量测定（n=3）

3.2 由于辛弗林属于生物碱类物质，极性较强，在一般液相条件下呈现极弱的保留，即使更换不同品牌、性质的色谱柱（如Agilent 公司的ZORBAX SBC18、Poroshell 120；Waters 公司的XBridgeTM C18；岛津公司的Inertsil ODS-SP；Thermo 公司的Syncronis C18）仍然得不到很好的分离。经过摸索，发现流动相中加入0.1%十二烷基硫酸钠，同时使用梯度洗脱可以使辛弗林的保留时间明显延后，并且不影响柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的分离。在上述色谱柱上均可以使测定组分满足分离要求。

3.3 根据4 种化合物紫外吸收波长的差别，并参照《中国药典》柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在283 nm、辛弗林在275 nm 有明显吸收，且杂质干扰少，故利用二极管阵列检测器的实时扫描功能，获得所有波长下的色谱图及即时的色谱图，从而达到同时测定4种成分含量的目的。见图2。

3.4 由于收集的样品来自饮片市场，多见隔年货或陈货（该品为少用中药），但是通过实验发现，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林不仅含量较高，而且含量相对稳定，故可作为质量控制的指标。

图2 紫外吸收光谱图

3.5 近些年来，研究者对生物类黄酮进行了大量的研究。其是自然界中存在的酚类物质，属植物的次级代谢产物，具有调节血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等生物活性。代代花中含有的黄酮类含量高于同科其他植物，其中橙皮苷、柚皮苷具有抗炎作用；所含的生物碱主要是辛弗林、N-甲基酪胺等，是升高血压、抗休克的主要有效成分。未来开展代代花在食疗、治疗抑郁及代代花茶饮品方面会有较大的发展空间，为综合利用代代花的资源，很有必要对其开展深入系统性研究。