张月芬，郭 丹，黄 慧，戴雅彬，张慧琳，倪 峰

福建卫生职业技术学院科技服务中心，福州350101

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是常见的男性泌尿系统恶性肿瘤，仅次于肺癌，跃居全球男性癌症的第二位，每年有超过127 万5 千例的新增病例和35 万例的死亡病例[1]。其特点是自然病史长且多变，恶性程度高，大多数前列腺癌患者在确诊时已经发生了重要器官和组织的转移。因此，寻找一种新型药物来辅助提高前列腺癌的治疗效果及改善患者预后，变得尤为重要与迫切。蛇葡萄素（ampelopsin，AMP）又名二氢杨梅素、双氢杨梅树皮素、福建茶素、白蔹素等，是葡萄科蛇葡萄属植物的一种有效黄酮类单体，其化学名为（2R，3R）-3，5，7-三羟基-2-（3，4，5-三羟基苯基） 苯并二氢吡喃-4-酮[2]。据文献报道，AMP 具有抗肿瘤、抗氧化、保肝护肝、治疗脑老化和神经退行性疾病等多种药理作用[3，4]，具有潜在的开发利用价值。本课题组最早研究并发现了蛇葡萄素可抑制人前列腺癌PC-3 细胞的增殖，并诱导其凋亡[5]，而此研究是前期工作的延续，旨在探讨蛇葡萄素对人前列腺癌DU145 细胞增殖、迁移和侵袭的影响，以期为蛇葡萄素对前列腺癌作用的深入研究和临床应用提供依据。

1 材 料

1.1 仪器

SW-CJ-1FD 超净工作台（苏净安泰公司）；Infinite F50 酶标仪 （瑞士Tecan 公司）；DMIL LED 倒置荧光显微镜（德国徕卡公司）；CLM-170B-8 二氧化碳培养箱 （新加坡ESCO 公司）；HC-3018R 台式高速冷冻离心机 （安徽中科中佳科学仪器有限公司）；PowerPac Basic 基础型蛋白电泳仪、Mini-PROTEAN Tetra Cell 小型垂直电泳槽、GelDoc XR+化学发光成像系统 （均为美国BIO-RAD 公司产品）。

1.2 药品与试剂

蛇葡萄素（AMP，纯度>98%）购自湖南希尔天然药业有限公司，实验前溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成浓度为100 mg·mL-1的储备液备用，使用时再用细胞培养基稀释成所需实验浓度；RPMI 1640培养基、磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自以色列BI 公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8） 试剂购自东仁化学科技有限公司；Matrigel 基质胶、Transwell 小室购自美国Corning 公司；人转化生长因子β（TGF-β）重组细胞因子购自美国PeproTech 公司；Vimentin 兔单克隆抗体Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗、Cy3 标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗均购自碧云天生物技术有限公司；E-cadherin 一抗、Vimentin 一抗购自沈阳万类生物科技有限公司；GAPDH、辣根过氧化物酶标记（HRP-conjugated Affinipure）的山羊抗鼠IgG（H+L）二抗、HRP 标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗，均购自Proteintech 公司；BCA 蛋白定量试剂盒，购自美国Thermo 公司；PVDF 膜购自德国Millipore 公司；ECL 化学发光试剂盒，购自苏州宇恒生物科技有限公司。

1.3 细胞株

人前列腺癌DU145 细胞，购自广州赛库生物技术有限公司。

2 方 法

2.1 细胞培养

DU145 细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，每2～3 天传代一次，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2 CCK-8 实验

取对数生长期的DU145 细胞，常规传代操作、计数，调整成适宜浓度的单细胞悬液，以1×104个细胞/孔接种于96 孔板中，待细胞贴壁后加入各浓度的AMP （0、6.25、12.5、25、50、60、80、100 μg·mL-1），分别继续培养24、48、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，于37 ℃避光继续培养2 h。用酶标仪于450 nm 波长处测定每孔的吸光度A 值，按下式，计算细胞存活率：

细胞存活率（%）=（A实验组-A空白调零孔）/（A空白对照组-A空白调零孔）×100%

2.3 克隆形成实验

将DU145 细胞接种于6 孔板中，细胞贴壁后加入不同浓度的AMP （0、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1）继续培养，48 h 后吸弃培养液，用磷酸缓冲液（PBS）清洗2～3 次，胰酶消化成单细胞悬液，计数，于新的6 孔板中以各实验组按1000 个细胞/孔进行接种，于37 ℃、5% CO2的培养箱中继续培养14 天，每2～3 天换液，当培养板中出现肉眼可见的集落时终止培养，吸弃培养液，用PBS 小心清洗3 遍，用4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛后再用PBS清洗3 遍，用0.1%结晶紫染色20 min，最后用PBS清洗3 遍，晾干后计数、拍照。

2.4 Transwell 实验

将对数生长期的DU145 细胞接种于6 孔板内，细胞贴壁后加入各浓度的AMP（0、10、20 μg·mL-1），继续培养24 h。此后将细胞常规消化，收集细胞，离心，PBS 清洗，最后用无血清的培养基重新悬浮细胞，计数。取Transwell 小室，在小室下层加600 μL含10%胎牛血清的培养基，上层加入200 μL 细胞悬液（迁移实验含1×104个细胞，侵袭实验含3×104个细胞）。在侵袭实验中，小室上层加细胞前铺每孔50 μL Matrigel 胶（按1∶8 比例用无血清RMPI 1640培养基稀释后使用）。24 h 后取出小室，吸弃培养液，PBS 清洗2 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗2 遍；0.1%结晶紫染色15 min，PBS 清洗3 遍，用棉签擦拭小室内面的未穿膜细胞，风干，置于倒置显微镜下观察并拍照。镜下随机选取7～10 个视野，计数穿过小室的细胞数目，取平均值用于表示肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

2.5 细胞免疫荧光实验

将无菌细胞爬片置于6 孔板内，取对数生长期的DU145 细胞，常规传代操作，计数，制成单细胞悬液，接种于6 孔板（每孔细胞约1×105个）上。待细胞密度达60%～70%时，更换成无血清的RPMI 1640培养基，让细胞饥饿24 h。分别加入0、2.5、5、10 ng·mL-1的TGF-β 细胞因子，继续培养48 h。吸尽培养液，加入4%多聚甲醛固定液，4 ℃过夜。去固定液，用免疫染色洗涤液摇床上洗3 次，每次5 min。吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗（1∶200 稀释），4 ℃孵育过夜。去除一抗，用免疫染色洗涤液于摇床上洗涤3 次，每次5 min。去除洗涤液，加入稀释好的荧光标记的二抗（1∶1000 稀释）避光摇床上孵育1 h。回收荧光标记二抗，用洗涤液洗涤3 次，每次5 min。滴1滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，于倒置荧光显微镜下观察、拍照。

2.6 Western blot 检测

取对数生长期细胞，常规传代操作，调整成适宜浓度的单细胞悬液，接种于6 孔板上，贴壁后分成对照组、TGF-β 组和TGF-β+AMP 组。TGF-β 组加10 ng·mL-1TGF-β 诱导EMT 模型。TGF-β+AMP组加10 ng·mL-1TGF-β 和25 μg·mL-1AMP。对照组加等体积溶剂。各组隔天换新。48 h 后，收集各组细胞，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，冰上裂解，按BCA 试剂盒说明提取各组细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF 膜。PVDF 膜用10%脱脂牛奶封闭非特异性抗原，于室温下孵育2 h 后分别加入相应浓度的E-cadherin、Vimentin，4 ℃下孵育过夜。TBST 清洗后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下继续孵育1.5 h。TBST 清洗后用ECL 法显色并曝光成像，以凝胶图像分析软件对胶片扫描，以GAPDH 作为内参照，用Image J 软件分析条带灰度值，统计目的蛋白的相对表达水平。

2.7 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 软件和SPSS 25.0 软件对实验数据进行处理，计量资料符合正态分布的数据用均数±标准差（）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05 表示差异有统计学意义。

图1 蛇葡萄素对人前列腺癌DU145 细胞增殖能力的影响

3 结果

3.1 AMP 对DU145 细胞增殖能力的影响

采用CCK-8 法分别检测了不同浓度AMP 在作用24、48、72h 后对前列腺癌DU145 细胞增殖的抑制作用，结果如图1A 所示。与对照组比较，AMP 25μg·mL-1浓度干预24 h 后细胞存活率开始明显降低（P<0.05），并且随着AMP 浓度增加及作用时间的延长，细胞的存活率也进一步降低。利用GraphPad Prism 8.0 软件拟合获得剂量反应曲线，计算得24、48、72 h的IC50分别为35.62、32.71、28.43 μg·mL-1。此外，克隆形成实验结果显示，12.5、25 μg·mL-1AMP 处理后，细胞的克隆数显著减少，50、100 μg·mL-1AMP处理后，细胞的克隆数极显著减少，证实AMP 能够降低DU145 细胞的集落形成（见图1B）。

3.2 AMP 对DU145 细胞迁移和侵袭能力的影响

通过Transwell 实验检测10、20 μg·mL-1AMP对DU145 细胞迁移和侵袭能力的影响，如图2 所示。与对照组相比，10、20 μg·mL-1AMP 穿膜细胞数明显减少，表明AMP 可明显抑制DU145 细胞的迁移和侵袭能力。

3.3 AMP 对DU145 细胞上皮间质转化（EMT）模型的影响

TGF-β 处理DU145 细胞48 h 后，显微镜下可见大部分细胞形态变成梭形，呈现间质细胞样（见图3B）。而对照组细胞为多角形，形态偏圆，细胞免疫荧光实验表征结果显示，与对照组相比，2.5、5、10ng·mL-1TGF-β 诱导组细胞内的E-cadherin 表达下调，Vimentin 表达上调，尤以10ng·mL-1TGF-β 诱导后上皮-间质转化EMT 的两个关键指标E-cadherin 和Vimentin 变化最明显 （见图3A）。通过进一步的Western blot 实验检测，结果如图3B 所示。与对照组相比，TGF-β 组和TGF-β+AMP 组细胞内E-cadherin表达下调，Vimentin 表达上调，与免疫荧光实验结果一致。同时，与TGF-β 组相比，TGF-β+AMP 组细胞内E-cadherin 表达变化无统计学差异，但Vimentin表达降低（P<0.05），表明AMP 具有逆转EMT 过程的作用。

4 讨论

AMP 是药食两用植物藤茶中含量甚高的一种黄酮类化合物，其食用的安全性也已得到证明[6]。大量的实验结果显示，AMP 作为藤茶中的主要生物活性成分，具有安全有效、多途径多靶点的药理作用，虽与杨梅素的结构相似，但对前列腺上皮细胞的毒性低于杨梅素[7]。在本研究中，AMP 可有效抑制前列腺癌DU145 细胞的增殖和集落形成，并呈现一定的浓度和时间依赖性，提示AMP 可能对前列腺癌具有一定的治疗价值。

图2 AMP 对人前列腺癌DU145 细胞迁移和侵袭能力的影响

侵袭和转移是前列腺癌恶化的重要指标，也是导致前列腺癌患者死亡的主要原因，因此，抑制癌细胞侵袭和转移成为治疗前列腺癌的潜在靶点之一[8]。肿瘤细胞迁移和侵袭是一种复杂的生物学行为，主要包括细胞黏附、基质降解和迁移运动等多个环节[9,10]。而且肿瘤细胞的迁移和侵袭速度越快，肿瘤转移能力越强，其恶性程度越高。本研究结果显示，在Transwell 实验中，与对照组相比，经AMP 处理后，从上室穿过基底膜的细胞数均显著减少，并且随着AMP 浓度增加穿膜细胞数也依次减少，表明了AMP 能够有效抑制DU145 细胞的迁移和侵袭。

1982 年Greenburg 和Hay 首次提出上皮-间质转化（EMT）这一概念，是指上皮细胞在一定条件下转化成间质细胞的过程，使之具有更强的迁移、侵袭及抗凋亡能力，并以上皮表型的缺失和间质表型的获得为主要特征[11]。上皮源性的恶性肿瘤发生EMT能够使肿瘤细胞摆脱细胞-细胞间连接而更具侵袭性，因此在肿瘤的侵袭和转移过程中起着重要作用。

图3 AMP 对DU145 细胞上皮间质转化（EMT）模型的影响

EMT 的主要特点是上皮表型标志物E-cadherin表达减少和间质表型标志物N-cadherin、Vimentin表达增加[12]。转化生长因子-β（TGF-β）已被证实为多种肿瘤EMT 发生的主要诱导剂，进而促进肿瘤侵袭转移[13]。本研究采用TGF-β 为诱导剂，以Ecadherin 表达下调和Vimentin 表达上调为指标，建立了人前列腺癌DU145 细胞的EMT 模型。

本研究还显示，AMP 干预后可显著降低TGF-β诱导的前列腺癌细胞EMT 模型的Vimentin 表达，从而抑制EMT 进程，这可能是其抑制人前列腺癌DU145 细胞迁移和侵袭的机制之一。

综上所述，AMP 能够有效抑制人前列腺癌DU145 细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其机制与下调TGF-β 诱导的前列腺癌细胞EMT 模型的Vimentin 表达，进而抑制EMT 进程有关。本研究结果为AMP 作为前列腺癌辅助治疗的备选药物提供了一些实验依据。当然，AMP 的抗癌作用机制，还有待后续的进一步深入探讨。