于宙 谷小凤 丁白瑜

摘要：建立了水产及其加工品中孔雀石绿及其代谢产物的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）测定方法。简化样品前处理步骤，省略液液萃取，减少固相萃取柱。样品采用经酸化乙腈提取，中性氧化铝粉分散固相萃取与阳离子交换柱净化，优化了阳离子交换柱淋洗液和洗脱液，经液相色谱分离，串联质谱多反应监测模式测定，内标法定量。方法的检出限0.2 μg/kg，定量限0.5 μg/kg，线性范围0.5～20.0 ng/mL，在0.5～2.0 μg/kg加标水平下孔雀石绿和无色孔雀石绿平均回收率分别为94.2%和92.0%，相对标准偏差均小于5%。该方法适用于水产及其加工品中孔雀石绿残留的测定。

关键词：孔雀石绿;无色孔雀石绿;水产及其加工品;液相色谱串联质谱

中图分类号：O657.63      文献标志码：A    doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.050

Abstract：A method of malachite green and leucomalachite green for the determination by liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）in aquatic products and their processed products was established. The sample pretreatment was simplified，the extraction was eliminated，one step of solid phase extraction was reduced，the cationic exchange elution solution and elution solution were optimized. Pretreatment improved to extract by acidified acetonitrile，the extractive compound purified by dispersive solid phase extraction and MCX solid phase extraction column，separated by liquid chromatography，determined by mass spectrometry，and quantified by internal standard. The detection limit of the method 0.2 μg/kg，the quantification limit 0.5 μg/kg，and the linear rang 0.5～20.0 ng/mL. The average recoveries of MG and LMG at 0.5～2.0 μg/kg were 94.2% and 92.0%，relative standard deviations were less than 5%. The method was suitable for the determination of malachite green residues in aquatic products and processed products.

Key words：malachite green（MG）;leucomalachite green（LMG）;aquatic products and processed products;liquid chromatography-mass spectrometry（LC-MS/MS）

孔雀石綠（Malachite Green，MG）既是染料，也是杀真菌、细菌、寄生虫的药物，可用作治理鱼类或鱼卵的寄生虫、真菌或细菌感染，但长期超量使用有潜在的致癌、致畸、致突变的作用[1]。孔雀石绿进入水生动物体内后，会快速代谢成脂溶性的无色（隐色）孔雀石绿（Leucomalachite Green，LMG）[2]。无公害水产养殖领域国家明令禁止添加，在养殖业中的使用未得到美国食品与药物管理局（FDA）的认可;根据欧盟法案2002/675/EC[3]的规定，动物源性食品中孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量限制  2 μg/kg;日本的“食品中残留农业化学品肯定列表制度（Positive List System）”规定在进口水产品中不得检出孔雀石绿残留;我国在农业行业标准《NY 5071—2002 无公害食品鱼药使用准则》中也将孔雀石绿列为不得使用的禁用药物。农业农村部公布的《食用动物禁用的兽药及其他化合物清单》中规定孔雀石绿原料药及其单方、复方制剂产品于2002年   4月15日一律停止使用。由于没有价格低廉有效的替代品，孔雀石绿在水产养殖中的使用屡禁不止。使用了含有MG与LMG原料的加工水产品如鱼片、干海参等也会含有残留物。每年由于孔雀石绿药物残留造成的退货和销毁事件，给企业造成巨大损失[4]。

水产及其加工品中含有较多脂肪等杂质，特别是水产加工品经过预处理、调味、干燥、烘烤等步骤，引入了食盐、味精、淀粉等调味料，基质更加复杂，净化提取困难，干扰MG、LMG的测定。现有测定方法有液相色谱法[5-8]、液相色谱串联质谱   法[9-18]、酶联免疫法[19]、电化学法[20-21]和离子阱质谱[22]等，其中应用最为广泛的是液相色谱法与液相色谱串联质谱法。液相色谱法采用溶剂提取、液液萃取和固相萃取柱净化，将MG用硼氢化钾还原为代谢产物LMG用荧光检测器检测;或以二氧化铅柱后衍生将LMG氧化为MG，以紫外或二极管阵列检测器测定总量。相比液相色谱法，LC-MS/MS具有专属性好、干扰少、灵敏度高和避免假阳性等优点，在定性与定量检测中表现良好，是简便快速的测定方法。

目前LC-MS/MS测定MG、LMG时存在以下缺点：一是液液萃取难分层;二是萃取液浓缩时目标化合物损失严重;三是阳离子交换柱净化时洗脱效果不佳，回收率较低。针对以上问题，试验改善了前处理方法，省去液液萃取、选择中性氧化铝粉分散固相萃取、优化阳离子交换柱淋洗及洗脱液[13，22]，显著降低目标物损失。

1   试验部分

1.1   仪器与试剂

乙腈、甲醇、甲酸，色谱纯，Honeywell霍尼韦尔公司提供;氨水、无水乙酸铵，分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供;超纯水（18.2MΩ），ELGA超纯水机，威立雅水处理技术有限公司提供。

标准品：孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、同位素内标氘代孔雀石綠（D5-MG）、氘代隐色孔雀石绿（D6-LMG），德国Dr.Ehrenstorfer公司提供。

5 mmol/L乙酸铵：称取0.385 0 g无水乙酸铵溶于1 000 mL水中，以冰乙酸调pH值到4.5，过0.2 μm滤膜;酸化乙腈：冰乙酸+乙腈= 2+98;甲酸溶液：加酸+水= 2+98;氨水甲醇：氨水+甲醇= 5+95。

Waters Xevo TQ-S 液相色谱串联质谱，沃特世公司提供。

XHF型均质器，宁波新芝生物科技有限公司产品;3-30K型离心机，德国SIGMA公司产品;DC型氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司产品;VOKTEX型涡旋混匀器，海门市贝尔仪器制造有限公司产品;12位SPE型固相萃取装置，德国CNW公司产品。

MCX阳离子交换柱：60 mg/3 mL，使用前依次以乙腈3 mL和2%甲酸溶液3 mL活化。

1.2   试验方法

1.2.1   工作曲线

称取适量MG，LMG，D5-MG，D6-LMG，以乙腈溶解配制成100 μg/mL标准储备液和内标储备液，临用前以乙腈稀释为100 ng/mL标准中间液和内标中间液。分别吸取一定量标准中间液和内标中间液，以5 mmol/L乙酸铵+乙腈=1+1稀释为MG，LMG质量浓度为0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL的工作液，该工作液中D5-MG，D6-LMG质量浓度均为2.0 ng/mL。

1.2.2   前处理方法

准确称取5 g样品于50 mL离心管中，添加100 μL内标中间液，加入12 mL酸化乙腈，均质30 s，另取10 mL酸化乙腈清洗均质刀头，超声提取3 min，离心后转移上清液，将清洗刀头的清洗液移入离心沉淀，涡旋分散残渣，超声提取5 min，离心后合并2次上清液。加入2g中性氧化铝粉，涡旋混匀并静置，过滤掉氧化铝粉。鲜活水产品定容至25 mL，取5 mL以初始流动相定容至1 mL，过膜待测;水产加工品通过阳离子交换柱，以5 mL酸化乙腈淋洗，弃去流出液，5 mL氨水甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至近干，以初始流动相定容至5 mL，过膜待测。

1.2.3   色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC C18色谱柱， 1.7 μm，2.1×50 mm;进样量10 μL，柱温30 ℃，流动相为5 mmol/L乙酸铵与乙腈。

梯度程序见表1。

1.2.4   质谱条件

电喷雾电离源，正离子模式，多反应监测扫描，毛细管电压0.6 V，源补偿电压50 V，脱溶剂气流量1 000 mL/min，锥孔气流量150 mL/min，碰撞气流速0.15 mL/min。

质谱条件见表2。

1.2.5   测定

内标法定量。

2   结果与分析

2.1   条件优化

2.1.1   前处理方法优化

前处理中，酸性提取液能促进目标化合物的溶解，若加入缓冲盐、离子对试剂，需使用二氯甲烷溶液萃取净化。水与二氯甲烷属于共轭溶液，较长时间离心才能分层，且萃取后的溶液体积较大，旋转蒸发浓缩时，MG和LMG损失严重。以冰乙酸酸化的乙腈提取，使用氧化铝粉吸附脂肪，为避免碱性和酸性氧化铝对目标化合物吸附，选择中性氧化铝粉分散固相萃取。三苯甲烷类属于弱碱性物质，针对水产加工品增加阳离子交换柱进一步净化。阳离子交换小柱要求上样溶液、淋洗溶液、洗脱溶液pka值应逐级升高，且pH值相差2以上，尝试不同的淋洗和洗脱溶液，选择酸化乙腈、氨水甲醇溶液时，目标化合物损失最小。

2.1.2   色谱条件

目标化合物在反相C18色谱柱上有保留，在乙腈中易溶，乙酸铵作为缓冲溶液提供合适的pH值并促进生成正离子，因此选择5 mmol/L乙酸铵与乙腈作为流动相。在梯度洗脱流速0.3 mL/min时，化合物有效分离，峰型较好，保留时间稳定，分析时间短，且基线稳定干扰少。

多反应监测谱图见图1。

2.1.3 质谱条件

目标化合物氢键供体数量为4，易形成M+1型分子离子峰，因此采用ESI+模式。首先通过母离子扫描得到MG，LMG，D5-MG，D6-LMG的质荷比分别为329，331，334，337 m/z，再通过子离子扫描得到离子碎片，选择最强丰度作为定量子离子，干扰较小离子作为定性子离子，确定多反应监测模式的离子对。

2.2   检出限与定量限

对系列标准溶液进行测定，以3倍信噪比S/N作为检出限，10倍信噪比为定量限。确定方法的检出限0.2 μg/kg，定量限0.5 μg/kg。

信噪比见图2。

2.3   回收率与精密度

选取21批鱼、鱼片和干海参等样品，按水产和加工品分成两类，每类3种，取可食部分，混匀制样，加入不同质量浓度水平的标准储备液作为加标样品。每个样品测定6次，同时测定空白样品，计算回收率与相对标准偏差。离子化效率高，基线噪音低。

回收率和标准偏差见表3。

3   结论

建立了LC-MS/MS测定水产及其加工品中MG，LMG残留量的方法。简化前处理步骤，选取合适的提取溶液直接提取，分散固相萃取代替固相萃取柱提纯，阳离子交换柱进一步净化，根据质谱分析优化选出酸化乙腈和氨水甲醇溶液为最佳的淋洗和洗脱液。该方法具有回收率高、精密度好、检出限低、干扰小、适用范围广等优势，能够快速、准确地获得分析效果。

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