张晓琳 刘颖 窦博鑫

摘要：以大豆分离蛋白（SPI）为原料，探讨转谷氨酰胺酶（TGase）对其起泡性及泡沫稳定性的影响，并对改性前后SPI的粒径、Zeta电位、游离巯基含量等理化性质与起泡性、泡沫稳定性之间的相关性进行分析。结果表明，TGase酶量40 U/g，pH值6.0，交联温度45 ℃，交联时间2 h为改善起泡性及泡沫稳定性的最优条件，此时起泡性和泡沫稳定性分别为52.65%，86.52%，较SPI原料分别提高46.66%，14.16%。粒径大小与起泡性和泡沫稳定性之间均存在显著正相关性（p<0.01），Zeta电位绝对值大小与起泡性之间呈显著正相关（p<0.01），游离巯基含量与起泡性之间呈显著负相关（p<0.01），与泡沫稳定性之间呈负相关（p<0.05），相关系数分别为0.752，0.623，0.672，-0.601，-0.475。

关键词：大豆分离蛋白;转谷氨酰胺酶;起泡性;泡沫稳定性;相关性

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A    doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.039

Abstract：Soy protein isolate（SPI）was used as raw material. The effect of transglutaminase（TGase）on its foaming capacity and foaming stability were investigated. Correlation analysis between physical and chemical properties such as particle size，Zeta potential and free sulfhydryl content before and after modification，foaming capacity and foaming stability were carried out. The results showed that the optimum conditions for improving foaming capacity and foaming stability were TGase amount 40 U/g，pH 6.0，temperature 45 ℃ and time 2 h. Under these conditions，the foaming capacity and foaming stability were 52.65% and 86.52%，respectively. Compared with SPI raw materials，they increased by 46.66% and 14.16% respectively. The particle size had a significant positive correlation（p<0.01）with foaming capacity and foaming stability，and the absolute value of Zeta potential had a significant positive correlation（p<0.01）with foaming capacity. There was a significant negative correlation（p<0.01）between free sulfhydryl content and foaming capacity，and a negative correlation（p<0.05）between free sulfhydryl content and foaming stability. The correlation coefficients were 0.752，0.623，0.672，-0.601，-0.475，respectively.

Key words：soy protein isolate;transglutaminase;foaming capacity;foaming stability;correlation analysis

大豆分離蛋白（SPI）是一种蛋白质含量在90%以上的优质植物蛋白，是具有起泡性、乳化性、溶解性、凝胶性等多种功能性质的常用食品基料。大豆分离蛋白因其较高的营养价值、经济价值及在食品体系中具有良好功能特性的优点，在食品加工领域备受重视[1]。起泡性是蛋白质应用于食品加工的一项重要功能性质，是影响多糖食品质量好坏的关键性因素[2]。许多加工食品，如冰激凌、蛋奶酥、奶油、蛋糕、面包、啤酒等均为泡沫型产品。然而，天然大豆分离蛋白的起泡能力和泡沫稳定能力并不理想，因此限制了其在食品工业中的广泛应用[3]。通过对大豆蛋白进行改性可以有效提高其起泡性，常用的改性方法有物理、化学及酶法改性，其中酶法改性具有高效性、专一性、多样性、温和性和无副产物等优点，对食物营养结构也无破坏作用[4]。

转谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase）是一种由331个氨基组成的具有活性中心的单体蛋白质，可以催化蛋白质或多肽发生分子内和分子间的共价交联，从而改善蛋白质的结构与功能[5]，尤其对蛋白质起泡性、乳化性、热稳定性和凝胶性能等改善效果显著，进而改善食品的口感风味、质地外观等，因此转谷氨酰胺酶在食品加工业中的应用颇受关注[6]。

试验以大豆分离蛋白（SPI）为原料，利用转谷氨酰胺酶（TGase）在不同条件下对其进行交联作用，研究TGase改性对大豆分离蛋白起泡性及泡沫稳定性的影响，并对改性前后粒径、Zeta电位、游离巯基含量等理化性质与起泡性、泡沫稳定性之间的相关性进行探讨。

1   材料与方法

1.1   主要材料与仪器

大豆分离蛋白，临沂山松生物制品有限公司提供;转谷氨酰胺酶（130 U/g），江苏一鸣生物股份有限公司提供;Ellman试剂，南京杜莱生物技术有限公司提供。

BS224S型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品;pHS-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂产品;SY-24型恒温水浴锅，天津欧诺仪器仪表有限公司产品;202型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品;TG16-WS型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品;XHF-DY型高速分散器，宁波新芝生物科技股份有限公司產品;Malvern激光粒度仪，上海思百吉仪器系统有限公司产品;722S型分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品。

1.2   试验方法

1.2.1   TGase交联SPI对其起泡性、泡沫稳定性的影响

将SPI配制成质量分数为5%的溶液，调整pH值后加入一定量的TGase，在指定温度下交联一段时间，交联结束后在80 ℃下灭酶5 min，获得交联物后取出，烘干备用[7]。分别探讨加酶量、pH值、温度和时间4个因素对TGase改善SPI起泡性及泡沫稳定性的影响。

（1）TGase酶量。以SPI溶液为底物，TGase酶量分别为10，20，30，40，50 U/g，在pH值7.0，温度55 ℃，时间1 h的条件下进行交联作用，测定TGase改性后样品的起泡性和泡沫稳定性。

（2）pH值。以SPI溶液为底物，分别调节pH值至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在TGase酶量40 U/g，温度55 ℃，时间1 h的条件下进行交联作用，测定TGase改性后样品的起泡性和泡沫稳定性。

（3）交联温度。以SPI溶液为底物，交联温度分别为25，35，45，55，65 ℃，在TGase酶量40 U/g，pH值6.0，时间1 h的条件下进行交联作用，测定TGase改性后样品的起泡性和泡沫稳定性。

（4）交联时间。以SPI溶液为底物，交联时间分别为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h，在TGase酶量40 U/g，pH值6.0，温度45 ℃的条件下进行交联作用，测定TGase改性后样品的起泡性和泡沫稳定性。

1.2.2   起泡性与泡沫稳定性的测定

用去离子水配制1%的蛋白溶液，振荡30 min充分溶解后以转速3 000 r/min离心15 min，再取30 mL上清液于高速分散器中，以转速10 000 r/min均质  1 min，记录泡沫体积（V0，mL），静置30 min后，再次记录泡沫体积（V30，mL）[8]。按以下公式分别计算样品的起泡性（Foaming Capacity，FC）和泡沫稳定性（Foaming Stability，FS）：

1.2.3   粒径与Zeta电位的测定

分别取0.1 g SPI原料与不同交联时间下的样品溶解于10 mL去离子水中，使用高速分散器以转速 5 000 r/min均质2 min完全混合，以转速3 000 r/min离心10 min后取上清液，用0.45 μm膜过滤后，测定粒径及Zeta电位[9]。

1.2.4   游离巯基含量的测定

采用Ellman法[10]测定游离巯基（SH）含量，取15 mg样品溶于5 mL Tris-Gly-8 M Urea溶液中振荡，加入100 μL Ellman试剂，于25 ℃下保温30 min，再以转速3 000 r/min离心15 min，取上清液，于波长412 nm处测定吸光度，以试剂空白校零，同时测定样品空白。按以下公式计算游离巯基含量：

式中：A412——除去样品空白和试剂空白后的吸光度;

D——稀释倍数;

C——样品中蛋白质含量，g/L;

13 600——Ellman试剂摩尔吸光系数，M-1cm-1。

1.2.5   数据处理与分析

采用Microsoft Office Excel 2007软件绘图，SPSS Statistics 17.0软件统计分析试验数据，每组试验均重复3次，数据结果以平均值±标准偏差表示，采用t检验，当p<0.05 时，表示差异显著。

2   结果与分析

2.1   TGase改善SPI起泡性、泡沫稳定性研究

2.1.1   SPI原料的起泡性及泡沫稳定性测定结果

根据试验数据，通过公式（1）及（2）计算得到SPI原料的起泡性为35.90%，泡沫稳定性为75.79%。

2.1.2   TGase交联SPI对其起泡性及泡沫稳定性的影响

不同因素对TGase交联SPI起泡性、泡沫稳定性的影响见图1。

由图1（a）可知，随着TGase酶的加入，交联样品的起泡性和泡沫稳定性也随之增强，当酶用量为40 U/g时均达到最大，分别为42.07%和76.14%，之后呈现下降趋势。可能是由于酶用量的增加使得酶与蛋白的接触概率增大，蛋白分子之间发生交联作用，膜上吸附的改性蛋白分子增加，膜的弹性及致密性提高，气体不易向外扩散[11]，因此利于起泡，同时泡沫存在的时间也会延长。但TGase酶的过度加入则会破坏体系所需要的亲水平衡，导致其起泡性和泡沫稳定性降低，所以确定最优酶用量为40 U/g。

由图1（b）可知，交联样品的起泡性和泡沫稳定性均先升高后降低，当pH值为6.0时达到最大，分别为45.95%和79.63%。由此可分析出，pH值对TGase交联SPI的起泡性和泡沫稳定性均有影响。大豆蛋白质在pH值4.5左右时达到等电点，此时溶解度最低，易于形成沉淀，而起泡性和泡沫稳定性均与溶解度有关[12]，所以在等电点附近，其起泡性和泡沫稳定性较低，在远离等电点后呈现先上升后下降的趋势。可溶性蛋白参与泡沫的形成，在等电点处可溶性蛋白浓度很低，形成的泡沫量很少。当pH值为6.0时，不溶性蛋白吸附在界面上，蛋白膜的黏着力增加，此时的体系有利于泡沫的形成[13]。随着pH值的升高，溶液环境碱性增强，酶的活性随之降低，使稳定环境受到破坏，导致其起泡性和泡沫稳定性减弱[14]，因此确定最佳pH值为6.0。

由图1（c）可知，起泡性和泡沫稳定性随着温度的升高而增大，当温度为45 ℃时达到峰值，分别为49.55%和81.91%，而后二者均下降。之所以出现此趋势可能是因为TGase酶有自身的最适温度，过低或过高都不利于TGase酶对SPI的交联，而一定程度的交联使蛋白分子疏水基团暴露，增加其吸附至界面的能力[15]。在最适温度时，酶交联反应速率最大，使蛋白分子得以最大程度的交联。当高于最适温度时，反应速率减小，同时蛋白质结构可能会遭到不同程度破坏，使蛋白质与水的相互作用被削   弱[16]，导致起泡性和泡沫稳定性降低。另外，观测到在45 ℃时产生的泡沫黏度比在其他温度条件下产生的略大，说明此温度下的泡沫稳定性最好。综上确定交联反应的最适温度为45 ℃。

由图1（d）可知，随着交联时间的延长，交联样品的起泡性和泡沫稳定性均随之增强，交联时间2 h时达到最大值，分别为52.65%和86.52%，而后略有下降。原因可能是在反应初期，随着时间的延长，蛋白分子中-NH2、-COOH之间形成的氢键增加，致使蛋白膜之间的机械强度提高[17]，从而起泡性提高。当反应时间过长时，气液两相间薄膜强度降   低[18]，故泡沫稳定性下降，起泡性也随之下降。综上确定交联反应的最适时间为2 h。

2.2   起泡性、泡沫稳定性与理化性质之间的相关关系

2.2.1   粒径与起泡性、泡沫稳定性之间的相关性分析

粒径与起泡性、泡沫稳定性之间的相关性见   图2。

SPI经TGase酶的交联作用使其粒径增大，通过SPSS软件中相关性分析得出，粒径大小与起泡性（R=0.752）和泡沫稳定性（R=0.623）之间均存在显著正相关性（p<0.01），由图2（a）与（b）可知，这与杨峰等人[19]得出的结论一致。

2.2.2   Zeta電位与起泡性、泡沫稳定性之间的相关性分析

电位与起泡性、泡沫稳定性之间的相关性见图3。

由图3（a）可知，可以看出随着Zeta电位绝对值的增加，其起泡性会出现明显的上升趋势。通过相关性分析得出，Zeta电位绝对值的大小与起泡性之间呈显著正相关（R=0.672，p<0.01）。但Zeta电位绝对值的大小与泡沫稳定性之间并不存在相关性（R=0.399，p>0.05）。

2.2.3   游离巯基含量与起泡性、泡沫稳定性之间的相关性分析

游离巯基含量与起泡性、泡沫稳定性之间的相关性见图4。

SPI经TGase酶的交联后，产物的游离巯基含量会发生变化。游离巯基含量的多少对大豆分离蛋白功能性质的影响很大，巯基是形成二硫键的原体，巯基和二硫键在蛋白分子结构中起到重要的作用[20]。经酶法改性后的蛋白多肽链构象的改变反映在巯基及二硫键含量的变化上，故探讨其对交联产物起泡性和泡沫稳定性的影响。

图4（a）为游离巯基含量与起泡性之间的关系。由SPSS软件中相关性分析得出，游离巯基含量与起泡性之间呈显著负相关（R=-0.601，p<0.01）。游离巯基含量少，起泡性反而大。游离巯基含量的变化引起其起泡性的显著变化，说明游离巯基的含量可以影响其起泡性能，同时也验证了交联作用的发生。通过分析图4（b）中游离巯基的含量与泡沫稳定性相关关系发现，泡沫稳定性与游离巯基含量之间的相关性稍差，游离巯基含量的变化并未导致其泡沫稳定性显著的升高或降低。由相关性分析可得出，游离巯基含量与泡沫稳定性之间仅存在微弱的负相关性（R=-0.475，p<0.05）。

3   结论

以大豆分离蛋白为试验原料，利用转谷氨酰胺酶在不同条件下交联，探讨酶用量、pH值、交联温度和交联时间4个因素对转谷氨酰胺酶改善大豆分离蛋白起泡性及泡沫稳定性的影响，确定酶用量       40 U/g，pH 值6.0，交联温度45 ℃，交联时间2 h为改善起泡性和泡沫稳定性的最优条件，此时起泡性为52.65%，较SPI原料提高46.66%;泡沫稳定性为86.52%，较SPI原料提高14.16%。

通过分析粒径、Zeta电位、游离巯基含量与起泡性、泡沫稳定性之间的关系，得到以下结论：粒径大小与起泡性和泡沫稳定性之间均存在显著正相关，相关系数分别为0.752和0.623（p<0.01）。Zeta电位绝对值的大小与起泡性之间呈显著正相关（R= 0.672，p<0.01），但与泡沫稳定性之间并不存在相关性（R=0.399，p>0.05）。游离巯基含量与起泡性之间呈显著负相关（R=-0.601，p<0.01），与泡沫稳定性之间呈负相关（R=-0.475，p<0.05）。

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