张延涛 孙 勇 张远鹏

(山东省济南市人民医院两腺外科，济南市 271100，电子邮箱：zhangyantao71@163.com)

近年来，乳腺癌的发病率呈上升趋势，严重危害妇女的身心健康，是全球妇女癌症死亡的主要原因[1]。目前，乳腺癌的主要治疗方法包括手术、化疗、放疗、激素治疗和靶向抗体治疗。乳腺癌整体治疗效果较好，但传统治疗方法仍存在缺乏特异性、化疗抵抗、易转移和复发等问题，这些都是乳腺癌治疗失败的原因[2]。寻找能选择性干预癌细胞信号传导、调控细胞增殖和分化的低分子肿瘤抑制物，是抗癌药物研究的重要方向，其中海洋生物活性物质抗肿瘤作用是重要的研究内容之一[3-4]。口虾蛄又名濑尿虾，是一种常见的海洋生物食材。近年研究发现，口虾蛄含有的生物碱和蛋白多肽类物质对肝癌、胃癌、鼻咽癌等肿瘤细胞的增殖有明显抑制作用[5]。但口虾蛄提取物(extract of Squilla oratoria,ESO)是否对耐药乳腺癌MCF-7细胞的增殖有抑制作用以及是否有广谱抗癌的特性，尚未见研究报道。本研究探讨ESO诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其机制，旨在为ESO用于乳腺癌的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 ESO的制备 于海鲜市场采购新鲜的口虾蛄50 kg，体长11～13 cm，体重30～40 g，产地为广东省湛江市。口虾蛄的促熟培育与抱卵孵化水质标准：溶氧5 mg/L，日换水1/4～1/3，透明度30～50 cm，水温控制在20℃～30℃，盐度各海区基本适合。烘干粉碎后称重，采用湿法提取口虾蛄抗肿瘤有效活性成分：用95%食用乙醇浸泡3次，48 h/次，浸泡液于室温下以3 000 r/min离心15 min后留取上清液；混匀后在56℃恒温下旋转蒸发12 h，得到乙醇粗提取物。乙醇粗提取物与水按1 ∶3体积比混合，60℃下搅拌，待有乳浊液分层出现，加入一半体积的乙酸乙酯充分震荡，待明显分层后，取上层黄色澄清溶液，经旋转蒸发仪减压浓缩得到黄褐色膏状物，即为口虾蛄乙酸乙酯提取物。临用前用含10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基将口虾蛄乙酸乙酯提取物母液稀释成所需终浓度5、10、20、40 μmol/L。

1.2 试剂与仪器 人乳腺癌MCF-7细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所(批号20180117)；杜氏改良伊格尔培养基购自美国HyClone公司(批号：AH0348)；胎牛血清购自美国Gibco公司(批号：MH0742)；细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)购自日本Dojindo公司(批号：20180109)；7500型实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)购自广州威佳科技有限公司(批号：20190203)；膜联蛋白V/碘化吡啶试剂盒购自美国BD公司(批号：559763)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit试剂盒购自美国BD公司(批号：20191015)。焦炭酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水、TRIzol试剂、逆转录试剂盒、Taq聚合酶、琼脂糖凝胶购自大连宝生物工程有限公司(批号：1612-42-6、50145121、161245、51211、B1223018)。青霉素链霉素双抗购自上海复申生物科技有限公司(批号:SV30010.01)。

1.3 细胞培养 在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素链霉素双抗的杜氏改良伊格尔培养基中接种MCF-7乳腺癌细胞，然后在37℃、5% CO2、饱和湿度的恒温箱中培养，待细胞进入指数生长期后进行传代培养。

1.4 细胞活力检测 分为空白对照、阴性对照及4个浓度ESO组进行实验。取对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔培养板中，每孔加入10 μL，约含3 000个细胞，在37℃、含5% CO2的恒温培养箱中培养24 h。空白对照组加入100 μL不含肿瘤细胞的完全培养基，阴性对照组加入等体积含肿瘤细胞的培养基，4个浓度ESO组分别加入5、10、20、40 μmol/L ESO，每个浓度设有3个平行复孔。分别培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，将培养板放入培养箱继续培养2 h，然后在酶标仪450 nm处读取吸光度(A)值，并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[(A阴性对照组-A实验组)/(A阴性对照组-A空白对照组)]×100%。

1.5 细胞凋亡检测 取对数生长期MCF-7细胞，调整浓度为1×106个/mL。用不同浓度(0、5、10、20、40 μmol/L)的ESO处理48 h，然后收集细胞悬液，以300 r/min离心10 min并弃上清，再用冷PBS洗涤2次。在2 mL结合缓冲液中轻轻再悬浮，将0 μmol/L ESO处理的MCF-7细胞以每管500 μL的量分装至空白对照组，同时将5、10、20、40 μmol/L ESO处理的MCF-7细胞以相同的量分别分装至5、10、20、40 μmol/L ESO组，即实验组。各组均加入5 μL膜联蛋白V和5 μL碘化吡啶，室温避光孵育20 min后，采用350目尼龙膜过滤，再用FACSCalibur流式细胞仪检测，实验重复3次取平均值。通过内部系统软件计算凋亡细胞的百分比。

1.6 细胞周期检测 取对数生长期MCF-7细胞，调整浓度为1×106个/mL，使用不同浓度(0、5、10、20、40 μmol/L)的ESO干预MCF-7细胞，继续培养48 h，然后用胰蛋白酶法采集细胞，PBS洗涤2次，采用-20℃预冷的70%乙醇固定，置于4℃冰箱中下保存过夜。固定好的细胞样本通过1 500 r/min离心去除乙醇，采用PBS洗涤2次，再悬浮在冷PBS中，然后加入20 μg RNase A(10 μg/mL)和2 μL碘化吡啶(2.5 μg/mL)染色液，4℃避光孵育30 min，采用350目尼龙膜过滤。用流式细胞仪测定各组细胞的DNA含量，并利用内置软件计算细胞周期百分率。

1.7 细胞凋亡相关基因表达量的检测 取对数生长期MCF-7细胞，调整浓度为1×106个/mL，用不同浓度(0、5、10、20、40 μmol/L)的ESO处理48 h，然后收集细胞悬液，用预冷的PBS洗2次后， 每孔加入100 μL预冷的RIPA细胞裂解液，将细胞刮下来后转移到EP管中，置于冰上裂解，4℃振摇30 min后，13 000 r/min离心10 min，收集上清。采用TRIzol法提取总RNA，并用琼脂糖凝胶电泳法鉴定RNA。将RNA(4 μL)加入反应混合物[4 μL 5×RT缓冲液、0.5 μL Oligo(dT)、0.5 μL dNTPs、1 μL M-MLV反转录酶、10 μL DEPC水]，按PrimeScriptTMRT Reagent Kit试剂盒说明书进行操作，37℃反应30 min，85℃反应5 s，95℃下终止反应5 min，使M-MLV反转录酶失活，合成第一链cDNA。以cDNA作为模板，利用合成好的特异性引物(上海杰盾生物技术有限公司设计)进行中间片段的扩增。每管为10 μL反应体系(Taq酶5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1 μL、DEPC水3 μL)，反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火及延伸30 s，前3个步骤经40个循环，65℃～95℃，每升高0.5℃保持5 s，采集荧光。p53、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p70s6k及内参基因引物序列见表1，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参，采用7500型实时荧光定量PCR仪进行mRNA表达量的检测。每次试验均设(无模板)对照，排除污染，每个样本重复3次。用Bio-Rad CFX Manager软件通过经内参GADPH校正后的Ct值和扩增效率自动计算各目的基因mRNA相对表达量。

表1 实时聚合酶链的引物序列

1.8 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，方差齐时，比较采用单因素方差分析，两两比较比较采用SNK-q法；方差不齐时，对数据转换后采用校正后的方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ESO对MCF-7细胞活性的影响 培养24 h、48 h、72 h时，半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分别为65.112 μmol/L、33.156 μmol/L、18.785 μmol/L。培养24 h、48 h、72 h后，不同浓度ESO组乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制率均高于阴性对照组，且培养24 h、48 h时，乳腺癌MCF-7细胞抑制率随ESO浓度升高而依次升高；培养72 h时，乳腺癌MCF-7细胞抑制率随干预浓度升高而依次升高；5、10、20 μmol/L ESO组乳腺癌MCF-7细胞抑制率均随培养时间延长而依次升高，40 μmol/L培养48 h、72 h的细胞抑制率均高于培养24 h时(均P<0.05)。见表2。

表2 5组乳腺癌MCF-7细胞培养24 h、48 h、72 h后的增殖抑制率(x±s，%)

2.2 ESO对MCF-7细胞凋亡的影响 给予5、10、20、40 μmol/L ESO干预MCF-7细胞48 h后，各ESO浓度组的细胞凋亡率均高于空白对照组，且细胞凋亡率随ESO给药浓度增加而升高(均P<0.05)。见表3和图1。

图1 不同浓度ESO诱导MCF-7细胞凋亡情况

表3 干预48 h后各组细胞的凋亡率比较(x±s，%)

2.3 ESO对MCF-7细胞周期的影响 ESO作用于人MCF-7细胞48 h后，出现G1期细胞阻滞现象，S期和G2期细胞均相应减少。10、20、40 μmol/L ESO组G0/G1期细胞百分率均高于0、5 μmol/L ESO组，且依次升高；20、40 μmol/L ESO组S期细胞百分率均低于其他ESO组，且40 μmol/L ESO组低于20 μmol/L ESO组；其他浓度ESO组G2/M期细胞百分率均低于0 μmol/L ESO组(均P<0.05)。见表4和图2。

图2 不同浓度ESO对MCF-7细胞周期的影响

表4 各细胞周期中各组的细胞百分率比较(x±s，%)

2.4 ESO对细胞凋亡相关基因表达的影响 MCF-7细胞的Bax mRNA 表达量随着ESO干预浓度增加而升高(均P<0.05)； 10、20、40 μmol/L ESO组p53 mRNA表达量均高于0、5 μmol/L ESO组，且依次升高(均P<0.05)；20、40 μmol/L ESO组 Bcl-2 mRNA表达量均低于0、5 μmol/L ESO组，且40 μmol/L ESO组低于10 μmol/L ESO组(均P<0.05)；其他浓度ESO组mTOR和p70s6k mRNA 表达量均低于0 μmol/L ESO组, 40 μmol/L ESO组mTOR mRNA 表达量低于5 μmol/L ESO组，且p70s6k mRNA 表达量低于5、10 μmol/L ESO组(均P<0.05)。见表5。

表5 5组细胞凋亡相关基因相对表达量比较(x±s)

3 讨 论

乳腺癌是一种常见且严重的女性肿瘤，近年来其发病率呈不断上升趋势。目前乳腺癌的临床治疗仍存在副作用严重和耐药性问题，亟需新的抗肿瘤药物改善病情[6]。许多天然化合物具有抗肿瘤作用，近年来从海洋生物中寻找抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物开发的策略之一。因此，本研究探讨ESO对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响具有重要意义。结果显示，ESO对MCF-7细胞具有抗增殖活性，并呈剂量依赖性和时间依赖性，且ESO干预后MCF-7细胞出现G1期细胞阻滞现象，这提示ESO可使乳腺癌MCF-7细胞周期发生阻滞从而抑制细胞增殖。

此外，我们发现ESO可诱导MCF-7细胞凋亡，且凋亡率呈剂量依赖性增加。程序性细胞死亡被证明是哺乳动物细胞在生理条件下死亡的主要形式，是一个快速且不可逆的过程[7]。Bcl-2家族的失调可能与逃避癌细胞凋亡有关[8]。Bax、Bcl-2是凋亡基因Bcl-2家族的两个重要成员，分别作为抗凋亡信号、促凋亡信号，通过形成同源二聚体来调节细胞凋亡[9]。促凋亡相关蛋白在人类众多癌症中往往呈低表达，而低表达的促凋亡蛋白因子会降低肿瘤耐药细胞对化疗的敏感性[10]。因此，寻找能够增加Bax表达或恢复肿瘤细胞凋亡能力的新的细胞毒性药物具有重要意义[11]。p53是与癌症相关的最常见突变基因，在多种应激诱发的凋亡中起关键作用[12]，其通过在G1期或间期停止细胞周期来阻止细胞复制，从而增强癌细胞凋亡[13]。本研究结果显示，经ESO干预后MCF-7细胞的p53和Bax mRNA表达量升高且呈剂量依赖性，而Bcl-2的表达量降低。有研究表明，野生型p53能够上调Bax、下调Bcl-2，进而导致程序性细胞死亡[14]。因此，推测ESO或通过上调p53的表达从而调控Bax和Bcl-2，进而在促进乳腺癌细胞凋亡的过程中发挥作用。然而，目前对Bcl-2和Bax的表达激活机制尚不完全清楚。

mTOR能驱动细胞增殖，在多种癌细胞系和乳腺癌中表达上调[15]。mTOR由多蛋白复合物mTORc1和mTORc2组成。mTORc1可磷酸化下游蛋白p70s6k，通过调节蛋白合成、核糖体生物发生和自噬来调节细胞生长[16-17]。本研究中，经ESO作用后，MCF-7细胞的mTOR和p70S6K的mRNA表达量均下降，提示ESO可能通过抑制mTOR通路，进而抑制MCF-7细胞增殖。已有研究证显示，p53可以通过激活AMP反应蛋白激酶抑制mTOR[18]，因此，p53调节的基因产物或可负调控mTOR通路，从而参与乳腺癌细胞的凋亡。目前，在许多研究中p53和mTOR通路都是单独靶向的，而不是共同靶向的，关于mTOR通路和p53通路之间相互作用的详细机制尚不清楚。因此，在今后的研究中，如何利用mTOR与p53之间的通路来制定治疗癌症的有效策略，仍有待解决。

综上所述，ESO可促乳腺癌MCF-7细胞周期发生阻滞从而抑制乳腺癌细胞增殖；此外，ESO可能通过上调p53的表达以调控Bax、Bcl-2、mTOR、p70s6k的表达，从而诱导MCF-7细胞凋亡。