张驰, 徐盟龙, 袁一心, 王朋涛, 靳晓慧, 魏战勇,

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002;2.河南省动物性食品安全重点实验室，河南 郑州 450002)

猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)属于细小病毒科，细小病毒属，呈圆形或六角形，是一种无囊膜病毒[1]。CARWRIGHT等[2]在流产仔猪中首次分离到该病毒。目前，已经发现7种PPV基因型。该病毒在中国猪群中存在广泛，通过对PPV感染的统计分析表明，国内不同地区均有PPV感染且感染率较高，西南、华北和华南地区的阳性率明显高于其他地区。PPV主要引起母猪繁殖障碍，引起流产，死胎，木乃伊胎，胎儿畸形和弱胎(SMEDI)[3]。研究发现，PPV的组织嗜性不断变化并趋向于广泛，而且与其他病原体混合感染增多，PPV4和PPV5可以侵染猪的肺脏，PPV6引起胎儿流产，PPV7不仅可以引起肠道病变，还表现出更广泛的组织嗜性[4]。在PCV2阳性猪群和腹泻猪群中均存在PPV的混合感染[5-6]。PPV基因组为5 000 bp左右，全基因组存在2个主要开放阅读框，位于3′端的ORF编码3个结构蛋白(又称衣壳蛋白)VP1、VP2和 VP3，5′端的ORF编码3个非结构蛋白(又称调节蛋白)NS1、NS2和 NS3[7]。NS1蛋白是其主要的非结构蛋白，其是一种磷酸化蛋白，具有多功能调节作用，主要在病毒的复制期产生，调控PPV基因组的复制。该蛋白存在一系列结构域。其中，2～275aa是DNA结合结构域，372～527aa是SF3解旋酶结构域，通过与小鼠细小病毒NS1蛋白的比较发现在PPV NS1蛋白N端存在内切酶区域并可能参与NS1蛋白与复制起点的结合，C端可能包含一个反式激活结构域，近年来的研究表明PPV 和PPV NS1蛋白能诱导细胞凋亡或通过TLRs介导激活宿主细胞的天然免疫应答[8-10]。

蛋白质在细胞核和细胞质之间的选择性转移为基因表达和进行其他细胞过程的调控提供强有力的机制[11]，蛋白质导入真核细胞的调控过程是由蛋白质导入受体识别的特异性核定位信号(NLSs)介导的[12]。核定位信号分为经典核定位信号和非经典核定位信号2种类型，经典核定位信号是由连续的富含碱性氨基酸(K/R)的短肽构成；非经典核定位信号是由不连续碱性氨基酸组成的非经典NLS，该NLS通过空间折叠或者经过蛋白质修饰形成或暴露并与核定位信号受体结合转运至细胞核[13-15]。

一些病毒蛋白是否进入细胞核对于调控病毒复制和产生细胞毒性起重要作用。细小病毒科阿留申水貂病毒(ADV)、人细小病毒(B19)、鼠细小病毒(MVM)的非结构蛋白NS1作为一种转录调控蛋白均主要存在于感染细胞核内并参与病毒的复制、基因转录调节以及核衣壳组装[16-17]。其中，ADV NS1通过非经典NLS进入细胞核，NS1蛋白上的227和285位的非碱性氨基酸天冬氨酸突变为谷氨酸后，NS1蛋白就不能入核，病毒复制减弱，一些观点认为酶切后的NS1蛋白暴露出B19 NS1核定位信号，使NS1蛋白能够转运至细胞核；B19 NS1通过经典核定位信号进入细胞核；MVM NS1通过214～216aa 3个连续的赖氨酸残基(KKK)介导NS1进入细胞核[18]。本研究中使用2种不同算法的核定位信号预测软件(Predict NLS、PSORT Ⅱ)预测PPV NS1的核定位信号，使用PSORT Ⅱ预测出与MVM NS1相似位置的215～218位存在4个连续的碱性氨基酸(KKRK)，但Predict NLS未发现其存在核定位信号，而猪细小病毒非结构蛋白NS1与上述细小病毒相似作为转录调控蛋白同样存在于感染细胞核内，而介导PPV NS1进入细胞核发挥其功能的核定位序列目前仍不清楚，为了探讨PPV NS1入核机制和NS1的核定位序列，使用重叠PCR技术将PPV NS1不同位置发生氨基酸缺失，运用免疫荧光和蛋白免疫印迹确定不同的NS1缺失突变体在细胞内的核定位情况，找到PPV NS1核定位序列存在的位置，为揭示PPV在宿主细胞内复制、NS1蛋白调控宿主与病毒自身基因转录的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、细胞、病毒 带有HA标签蛋白的pCAGGS-HA质粒购自宝生物工程(大连)有限公司；PK-15细胞由河南省动物性食品安全重点实验室传代保存；猪细小病毒李氏毒株[19]，由河南省动物性食品安全重点实验室传代保存。

1.1.2 主要试剂 PCR高保真聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内切酶，T4连接酶购自New England Biolabs公司；胎牛血清、DMEM培养基，opti-MEM减血清培养基均购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2 000转染试剂购自Invitrogen公司；蛋白裂解试剂和亚细胞结构胞浆和胞核蛋白提取试剂盒购自武汉BOSTER生物工程有限公司；鼠源HA标签抗体、鼠源β-actin内参抗体、兔源核内参TBP抗体、HRP标记羊抗鼠IgG、HRP标记羊抗兔IgG、FITC标记猴抗鼠IgG均购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 低温高速离心机5430R购自Eppendorf公司；PCR扩增仪Veriti购自美国应用生物系统公司；电泳仪DYY-6C购自北京六一仪器厂；凝胶成像分析系统购自美国ProteinSimple公司；半干转印槽Rrans-BlotSD购自美国BIO-RAD公司；倒置荧光显微镜IX73购自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 猪细小病毒非结构蛋白NS1核定位信号分析 将PPV NS1氨基酸序列提交至Predict NLS(https://rostlab.org/owiki/index. php/PredictNLS)和PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form.html)预测网站，并分析预测结果。

1.2.2 猪细小病毒非结构蛋白NS1 CDS区基因和NS165-133aaDel、NS1207-267aaDel的扩增 根据GenBank上传的猪细小病毒非结构蛋白NS1的序列使用primer5.0软件分别设计NS1 CDS区引物和NS165-133aaDel、NS1207-267aaDel重叠PCR引物，NS1 CDS区引物序列为：F1；R1；NS165-133aaDel重叠PCR引物为：F1；F2；R1；R2；NS1207-267aaDel重叠PCR引物为：F1；F3；R3；R1，见表1。以河南省动物性食品安全重点实验室保存的猪细小病毒提取DNA为模板，使用高保真酶扩增NS1 CDS区基因序列，PCR扩增程序为：98 ℃，5 min：98 ℃，20 s；55 ℃，45 s；68 ℃，2 min 10 s，35个循环，68 ℃，10 min；4 ℃保存。PCR扩增NS1 CDS区；使用重叠延伸PCR分别扩增NS165-133aaDel和NS1207-267aaDel序列：(1)分别使用引物F1、R2和F2、R1扩增猪细小病毒非结构蛋白L1、L2片段，使用引物F1、R3和F3、R1扩增猪细小病毒非结构蛋白L3、L4片段；(2)以L1、L2和L3、L4胶回收产物为模板使用引物F1、R1扩增出NS165-133aaDel(L5)和NS1207-267aaDel(L6)序列，扩增程序与上述程序相同。

1.2.3 pCAGGS-HA-NS1和pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel重组质粒的构建 使用限制性内切酶ECoRI、XhoI酶切pCAGGS-HA载体、NS1、NS165-133aaDel和NS1207-267aaDelPCR回收产物37 ℃，3.5 h，1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收双酶切后的PCR产物及载体，使用T4连接酶16 ℃连接过夜后转化入DH-5α感受态细胞，挑取单个菌落，使用pCAGGS-HA通用引物进行菌液PCR扩增，筛选出阳性菌落并扩大培养，送测序公司进行测序，将测序正确的菌液提取质粒使用限制性内切酶ECoRI、XhoI进行双酶切验证。

1.2.4 重组质粒转染PK-15细胞和Western-blot检测 使用含10%胎牛血清的培养基培养PK-15细胞，细胞长满后使用0.25 %胰酶消化，用显微镜观察待细胞消化为单个细胞时，将胰酶弃去，加入含10 %胎牛血清的DMEM培养基，使用细胞吹管将细胞进一步吹散后铺于六孔板中，使细胞在18～24 h后长至80 %时进行转染；配制转染液A：50 μL 无血清的opti-MEM加入1 μg重组质粒轻柔混匀，静置5 min；转染液B：50 μL 无血清的opti-MEM加入5 μL Lipofectamine 2 000轻柔混匀，静置5 min，将A液缓慢加入B液中轻柔混匀，静置25 min。六孔板中的PK-15细胞用高压过的D-Hank’s洗3次后更换为无血清的opti-MEM培养基，将静置后的A、B转染混合液加入细胞孔中，转染6 h后细胞培养液更换为含2 %胎牛血清的培养基。转染36 h后收取细胞，4 ℃ 1 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，细胞沉淀使用含1 % PMSF的RIPA细胞裂解液冰上裂解细胞，作用30 min，4℃ 13 000 r·min-1离心10 min，取上清液即为细胞总蛋白。抽取10 μL细胞总蛋白加入2 μL 6×SDS Protein Buffer，100 ℃变性蛋白5 min，进行SDS-PAGE(5%)电泳后转到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5 %脱脂奶封闭1 h，鼠源抗HA标签抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗5次，每次10 min，1∶5 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，TBST洗5次，每次10 min，使用ECL发光显色液显色。

1.2.5 间接免疫荧光检测目的蛋白细胞定位 PK-15细胞转染重组质粒pCAGGS-HA-NS1、pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel36 h后，使用无水乙醇固定细胞，过夜，PBS洗3次，5% BSA 37 ℃封闭2 h，PBS洗3次，鼠源HA标签抗体4 ℃孵育过夜，PBST洗5次，每次10 min，1∶100 FITC标记的猴抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，PBST洗5次，DAPI 37 ℃染核10 min，PBST洗5次，加入抗荧光衰减封片剂，倒置荧光显微镜下观察。

1.2.6 Western-blot检测检测目的蛋白细胞定位

PK-15细胞转染重组质粒pCAGGS-HA-NS1或pCAGGS-HA-NS165-133aaDel、pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel36 h后收取细胞，4 ℃ 1 000 r·min-1离心10 min，弃上清液。细胞沉淀使用亚细胞结构胞浆和胞核蛋白提取试剂盒分别提取胞浆和胞核蛋白，抽取10 μL细胞总蛋白加入2 μL 6×SDS Protein Buffer，100 ℃变性蛋白5 min，进行SDS-PAGE(5%)电泳后转到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5 %脱脂奶封闭1 h，鼠源HA标签抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗5次，每次10 min，1∶5 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG 37 ℃孵育1 h，TBST洗5次，每次10 min，使用ECL发光显色液显色。

表1 PCR和重叠PCR引物Table 1 Primers for PCR and overlapping PCR

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析结果

PPV NS1经Predict NLS预测网站分析，未发现核定位信号NLS，但PSORT Ⅱ预测出NS1 215-218aa(KKRK)为其核定位信号，PredictNLS预测网站比PSORT Ⅱ预测结果更严格，PSORT Ⅱ预测出的NLS可能是由于已经确定的与PPV NS1同源性较高的MVM NS1(二者同源性为70%左右)在相似位置存在NLS。

2.2 目的基因的扩增结果

分别使用引物F1、R2；F2、R1；F1、R3；F3、R1以PPV DNA为模板使用PCR高保真酶扩增目的基因，经1%凝胶电泳检测，发现扩增出220 bp(L1)、1 594 bp(L2)、644 bp(L3)、1 192 bp(L4)片段(图1)，均与预期结果相符。分别回收目的片段并使用引物F1、R1分别以L1、L2；L3、L4、PPV DNA为模板，使用PCR高保真聚合酶扩增出目的片段NS1、L5、L6，经1%凝胶电泳检测，扩增片段大小为1 986 bp(NS1)、1 779 bp(L5)、1 803 bp(L6)(图2)，与预期相符。

Marker:DNA分子质量标准;

Marker:DNA分子质量标准;N:阴性对照;1:NS1;2:L5;3:L6

2.3 重组质粒的构建和鉴定

经菌液PCR鉴定正确的含重组质粒的菌液送测序公司测序，NS1测序序列与GenBank上传的猪细小病毒非结构蛋白NS1一致，NS165-133aaDel和NS1207-267aaDel均在目的位置发生缺失，其余位置未发生缺失或突变，提取质粒，经双酶切鉴定正确(图3)。

2.4 真核表达目的蛋白的鉴定

提取转染36 h后的细胞总蛋白，经HA标签抗体检测(图4)，分别在目的位置显示出条带，证明NS1、NS165-133aaDel、NS1207-267aaDel均成功表达。

2.5 目的蛋白的细胞定位鉴定

通过免疫荧光和Western-blot鉴定目的蛋白在细胞内的核定位情况。免疫荧光结果显示：NS1蛋白和NS1207-267aaDel蛋白定位于细胞核中，而NS165-133aaDel蛋白定位于细胞质中(图5)。Western-blot分别检测细胞核和细胞质内目的蛋白的存在情况，结果同样显示NS1蛋白和NS1207-267aaDel蛋白定位于细胞核中，而NS165-133aaDel蛋白定位于细胞质中(图6、图7)。

Marker:DNA分子质量标准;1:pCAGGS-HA;2:pCAGGS-HA-NS1;3:pCAGGS-HA-NS165-133aaDel;4:pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel

Marker:蛋白分子质量标准;1:pCAGGS-HA;2:pCAGGS-HA-NS1;3:pCAGGS-HA-NS165-133aaDel;4:pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel

图5 免疫荧光鉴定目的蛋白细胞内核定位(×400)Fig.5 Identification of target protein in nuclear localization by IFA(×400)

3 结论与讨论

PPV能通过胎盘屏障，主要感染胎盘和胎儿中快速分裂的细胞导致妊娠母猪子宫内膜炎、上皮细胞死亡和胎儿感染，尤其是内皮组织损伤引起母猪繁殖障碍，造成流产、死胎、木乃伊胎、胎儿畸形和弱胎，对养猪业造成巨大的经济损失。PPV引起的细胞死亡和组织损伤被认为是母猪繁殖障碍的重要致病因素。人工感染PPV能显著降低猪黄体的血清孕酮浓度，并诱导黄体和猪类固醇黄体细胞(SLCs)产生细胞病变效应(CPE)或细胞凋亡，体外感染试验表明PPV也能通过线粒体凋亡途径诱导猪SLCs原代细胞、猪传代细胞系ST细胞发生凋亡[10,20]。LIU等[21]的研究发现，PPV能够感染并引起猪外周血单核巨噬细胞(PBMC)发生细胞凋亡。作为病毒调控蛋白的非结构蛋白NS1被认为是引起细胞凋亡的主要病毒蛋白。ZHANG等[22]的研究表明，PPV NS1能诱导内源性ROS/线粒体介导的细胞凋亡。作者前期的试验表明，PPV通过与PK-15细胞Tolls样受体2、7、9结合，激活NF-кB信号途径[8-9]，PPV NS1通过TLR2引起MyD88介导的NF-κB信号通路的激活调控宿主细胞的天然免疫反应。因此，NS1蛋白同样是引起宿主细胞炎性应答的主要蛋白，但NS1激活NF-кB信号通路导致细胞炎性反应和引起细胞凋亡的功能域尚需进一步研究。

Marker:蛋白分子质量标准;1:pCAGGS-HA;2:pCAGGS-HA-NS1;3:pCAGGS-HA-NS165-133aaDel;4:pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel

Marker:蛋白分子质量标准;1:pCAGGS-HA;2:pCAGGS-HA-NS1;3:pCAGGS-HA-NS165-133aaDel;4:pCAGGS-HA-NS1207-267aaDel

很多调控病毒复制的病毒蛋白是否能进入细胞核是发挥其调控病毒复制或核衣壳组装作用的关键。段志强等[23]的研究发现，将鸡新城疫病毒M蛋白核定位信号突变后的拯救病毒M蛋白核定位功能丧失，病毒粒子的毒力、在鸡胚的感染能力及在形成细胞空斑能力均显著降低。徐文章[24]的研究发现，H1N1亚型流感病毒NP蛋白NLS3上的373位苏氨酸突变为丙氨酸后减弱了NP蛋白的入核功能，并且对转染细胞内病毒复制所需聚合酶的活性产生抑制。WANG等[25]的试验表明，将PRRSV的N蛋白、NLS1、NLS1,2上的赖氨酸突变为精氨酸后，NLS1、NLS1，2突变毒株的核定位仅仅从核仁定位改变为核质定位，突变体拯救病毒的体外增殖能力显著低于亲本病毒，这些突变体毒株同样减弱了对IFN-β和IRFs启动子的抑制能力。其次，副黏病毒 M 蛋白、人畜共患病尼帕病毒 M 蛋白入核均对病毒的复制存在正向调控作用[26-28]。另外，有研究认为，VSV 的 M 蛋白会通过进入细胞核抑制宿主细胞的转录与翻译[29-31]，即通过抑制宿主细胞抗病毒基因表达，从而为病毒的增殖提供有利的细胞内环境。但是也有研究发现并不是所有的病毒蛋白入核都能增强其对病毒复制的调控。刘忠钰等[32]将登革病毒C蛋白核定位序列突变为非核定位序列后反而对病毒RNA的复制起到促进作用。A型流感病毒 H5N1 NS1 蛋白是否存在细胞核定位对病毒的复制和致病性无明显影响，但该病毒蛋白的核定位对于细胞调控抗病毒应答的能力极其重要。

在细小病毒家族中已经证实ADV、B19、MVM的非结构蛋白NS1蛋白均可进入细胞核参与病毒的复制、核衣壳组装，介导这些蛋白进入细胞核的核定位信号也已经探明，但猪细小病毒NS1的入核定位信号仍不清楚。ADV、B19、MVM、PPV的非结构蛋白NS1均能引起细胞凋亡，并且ADV NS1的NLS突变丧失入核功能后，病毒的复制减弱[33-35]，这些细胞凋亡及调控病毒的复制过程是否和NS1蛋白入核密切相关尚需研究。本研究通过比对PPV NS1和MVM NS1氨基酸同源性后发现二者氨基酸同源性为70%左右。有研究发现MVM NS1上214～216aa3个连续的赖氨酸残基(KKK)介导NS1进入细胞核[18]，与MVM NS1 相似的是PPV NS1 215～218aa同样存在4个连续碱性氨基酸(KKRK)，为了验证介导PPV NS1进入细胞核的NLS是否在该区域，通过重叠PCR技术扩增并构建了一系列NS1缺失突变体，构建的缺失载体NS165-133aaDel、NS1207-267aaDel均成功在PK-15细胞内表达，通过免疫荧光和Western-blot发现缺失包括215～218aa在内的NS1207-267aaDel细胞定位与NS1定位一致，均存在于细胞核中；而缺失了65～133aa的NS165-133aaDel细胞定位由细胞核改变为细胞质，说明PPV NS1的NLS与MVM NS1不同，其与MVM NS1相似的215～218aa 4个碱性氨基酸并不像MVM NS1一样介导NS1蛋白入核，PPV NS1的NLS存在于65～133aa之间，这有可能是PPV NS1与MVM NS1蛋白之间的差异氨基酸引起空间构象的不同导致的，而且结合PPV NS1的NLS预测结果提示介导PPV NS1入核的NLS属于非经典核定位信号。本研究为进一步阐明PPV病毒复制机制和NS1调控细胞基因转录机制奠定了基础。

目前，需要构建猪细小病毒反向遗传系统来研究PPV NS1缺失65～133aa内的NLS后是否对细小病毒的复制、引起的细胞凋亡或天然免疫反应的激活产生影响，长期以来，由于细小病毒基因结构的特殊性，即基因组两端存在较长的发卡结构对于细小病毒的反向遗传系统的建立造成了极大困难。但是，ZHANG等[36]成功构建了猪细小病毒的感染性克隆，为研究猪细小病毒的感染机制提供了新平台。