贾保顺，孙祖正，张锦中，朱学杰

(1.河南省烟草公司周口市公司，河南 周口 466000；2.河南省烟草公司南阳市公司，河南 南阳 473000)

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2018年在河南省周口市商水县郝岗乡(东经114°29′，北纬33°70′)进行。该区属于亚热带向暖温带过渡区，年平均气温14.5 ℃，年平均日照2 094.9 h，年平均降雨量785.1 mm。选用当地主栽烤烟品种K 326和NC 71为试验材料，烟苗于2018-05-07移栽，单株有效叶数18～20片，按当地优质烟叶生产进行田间管理。试验地土壤为黄褐土，土壤基本理化性质：有机质14.29 g·kg-1，碱解氮71.39 mg·kg-1，速效磷13.79 mg·kg-1，速效钾105.13 mg·kg-1，pH值7.19。烟田施用肥料为烟草专用复合肥，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶1∶2，烟田施氮量为75 kg·hm-2，由周口市烟草公司提供。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计，各个品种重复3次，共45个小区，每个小区36株烟，烤烟行株距1.2 m×0.5 m。试验设置5个取样时期，自烟叶打顶10 d(即移栽后70 d)后开始取样，随后每隔10 d取样1次，共取样5次，移栽后90 d中部叶进入成熟阶段。每次取样时选取小区内长势均匀一致的烟株，试验部位为中部叶(10～12叶位)。每个品种各选5株，取样时选取大小均匀的烟叶，去除叶片主脉，取第7至第8支脉部分叶肉组织，混合样品，每份样品约6 g，放于液氮中速冻后，于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于氮代谢酶活性和基因表达量测定。另取一部分烟叶于105 ℃下杀青25 min，然后再65 ℃烘干，研磨后过60目筛，用于化学成分测定。每个处理进行3次重复。

1.3 测定项目及方法

1.3.2 氮代谢关键酶活性测定 谷氨酰胺合成酶(GS)活性测定参照O′NEAL等[15]的方法，以1 mg·min-1粗蛋白质催化产生的γ-谷氨酰异羟肟酸数量来表示；谷氨酸脱氢酶(GDH)活性测定参照TURANO等[16]的方法，以每分反应混合液于30 ℃减少的还原型辅酶Ⅰ(NADH)数量(μmol)来表示；硝酸还原酶(NR)活性测定采用活体法，以单位样品单位时间内产生的亚硝酸含量来表示；谷氨酸合成酶(GOGAT)活性参照郑朝峰等[17]的方法。

1.3.3 氮代谢相关基因表达分析 采用Trizol法提取用品内总RNA，通过随机引物法反转录合成cDNA[18]。根据GenBank公布的氮代谢相关基因NR，GS和GOGAT的序列，采用Roche LCPDS2设计引物，引物列表见表1。以烤烟核糖体蛋白质基因Nt25[19]为内参基因进行qRT-PCR。试验结果采用2-ΔΔCt算法[20]进行分析。每个样品进行3次重复。

表1 氮代谢相关基因qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR of nitrogen metabolism related genes

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2010进行整理和作图，采用SPSS 22.0软件进行Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 烤烟成熟期含氮化合物含量的变化

如图1-a所示，烤烟K 326和NC 71叶片铵浓度在叶片成熟期先升高后降低，移栽后80 d，2个品种烤烟叶片铵浓度达到峰值，其叶片铵浓度分别为7.09和7.83 mmol·L-1，随后其叶片铵浓度快速下降并趋于稳定。如图1-b所示，自移栽后70 d开始，K 326和NC 71烟叶可溶性蛋白质含量逐渐降低，但整个成熟期NC 71叶片可溶性蛋白质含量均略高于K 326。与叶片铵浓度相比，烤烟成熟期叶片总氮含量变化波动较小(图1-c)，从移栽后70 d起，叶片总氮含量缓慢下降，并于移栽后100 d逐渐稳定，此时K 326和NC 71叶片总氮含量分别为29.2和28.9 g·kg-1。如图1-d所示，烤烟成熟期叶片游离氨基酸含量与可溶性蛋白质含量变化趋势相似，成熟期K 326和NC 71游离氨基酸含量呈不同程度下降的变化趋势，叶片成熟时(移栽后90 d)，其游离氨基酸含量分别为7.95和8.12 mg·g-1。

图1 烤烟成熟期含氮化合物含量动态变化Fig.1 Dynamic changes of nitrogen compounds content in flue-cured tobacco at mature stage

2.2 烤烟成熟期氮代谢关键酶活性的变化

如图2-a所示，在K 326和NC 71烟叶中，GS活性具有相同的动态变化，成熟期GS活性呈先升高后降低的变化趋势。K 326和NC 71叶片GS活性在移栽后80 d达到最高，分别为197.8和221.3 nmol·mg-1·min-1，之后GS活性逐渐下降。2个品种烤烟GDH和GOGAT活性与GS活性变化趋势相同(图2-b,c)，均呈单峰波动趋势，且在移栽后80 d其GDH和GOGAT活性最高；与GS活性不同的是，K 326和NC 71叶片GDH活性在移栽后100 d快速降低，移栽后110 d时，其GDH活性分别为57.5和68.9 nmol·mg-1·min-1。与GS，GDH和GOGAT活性变化不同，K 326和NC 71叶片内NR活性在成熟期呈逐渐降低的变化趋势(图2-d)，叶片成熟时(移栽后90 d)，两个品种烤烟NR活性分别为1.99和2.24 μg·g-1·h-1。综合分析成熟期K 326和NC 71氮代谢关键酶活性变化可知，成熟期NC 71氮代谢关键酶活性均略高于K 326。

图2 烤烟成熟期氮代谢关键酶活性的变化Fig.2 Changes of key enzymes activities of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco at mature stage

2.3 烤烟成熟期氮代谢关键酶基因表达量的变化

如图3所示，通过对烤烟K 326和NC 71成熟期烟叶氮代谢关键酶基因(NtNR，NtGS，NtGOGAT)相对表达量的分析发现，烟叶成熟期NtNR基因相对表达量呈逐渐降低的变化趋势，移栽100 d后，NtNR基因相对表达量趋于稳定。K 326和NC 71在移栽后80 d具有较高的NtGS基因相对表达量，之后其基因相对表达量快速下调。NtGOGAT基因相对表达量与NtGS基因相对表达量变化相似，呈先上升后下降的单峰波动变化，移栽后80 d之后，其基因相对表达量逐渐下调。与NtGS基因表达量相比，烟叶成熟期NtGOGAT基因相对表达量较低。自移栽后90 d起，K 326与NC 71叶片NtGOGAT基因相对表达量差异不显著。

2.4 烤烟成熟期氮代谢酶活性、基因表达量与含氮化合物的相关性

如表3所示，分析了烤烟成熟期氮代谢酶活性与基因表达量之间的相关性。结果表明，烤烟成熟期氮代谢关键酶基因相对表达量与酶活性之间呈正相关水平，NtNR与NR活性之间相关性达显著水平；NtGS与各酶活性之间相关性均达到显著水平；NtGOGAT与GS，GOGAT活性之间呈极显著正相关水平，与GDH之间呈显著正相关水平。

图3 烤烟成熟期氮代谢关键酶基因表达量的动态变化Fig.3 Dynamic changes of gene expression of key enzymes of nitrogen metabolism in flue-cured tobacco at mature stage

表2 烤烟成熟期氮代谢酶活性及基因表达量与含氮化合物的相关性Table 2 Correlation between nitrogen metabolic enzyme activity and gene expression and nitrogen compounds in flue-cured tobacco at mature stage

表3 烤烟成熟期氮代谢酶活性与基因表达量的相关性Table 3 Correlation between nitrogen metabolic enzyme activity and gene expression in flue-cured tobacco at mature stage

3 结论与讨论