如克亚木·阿不都沙拉木 古丽巴哈尔·阿不拉合买提 李树涛 阿布都沙拉木·托合提

耐多药肺结核是指感染结核分枝杆菌后对利福平耐药、异烟肼耐药的肺结核，其主要特点为高治疗费、低治愈率及高死亡率，是临床结核病治疗的难题之一[1-2]。据相关研究证实，其病因与临床不合理用药相关，因机体内基因突变造成药物降低对突变菌的作用，故耐药菌株增多是诱发耐药的重要原因[3-4]。结核分支杆菌属于胞内寄生菌，细胞免疫是机体内主要的抗结核免疫，而机体内T淋巴细胞亚群及其细胞因子与细胞免疫强弱密切相关。因此结核病的研究重点是分析其细胞免疫。经查阅发现Th1/Th2/Treg细胞及相应细胞因子水平在耐多药结核患者中的研究甚少，因此本研究将探讨外周血Th1/Th2/Treg细胞及相应细胞因子水平在耐多药结核患者中的诊断价值及意义，以期为临床提供理论依据。

资料与方法

一、患者临床资料

回顾性分析自2016年2月-2020年2月于我院接受治疗的肺结核患者99例，分为无耐药组和耐药组，其中无耐药组：肺结核患者共52例，男31例(占比59.62%)，女21例(占比40.38%)，年龄为20～54岁、平均年龄为(34.83±7.21)岁；耐药组：肺结核患者47例，男27例(占比57.45%)，女20例(占比42.55%)，年龄为19～54岁、平均年龄为(34.62±7.35)岁；另外抽取同期体检的健康者76例作为健康组：男45例(占比59.21%)，女31例(占比40.79%)，年龄为20～53岁、平均年龄为(34.48±7.19)岁。

三组患者一般资料差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。本研究方案的制定符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的相关要求。

二、入选标准

纳入标准：肺结核根据《肺结核诊断和治疗指南》中的相关标准，耐多药肺结核根据2019版《耐多药肺结核诊断和治疗指南》中的相关标准，且经X线胸片或胸部CT诊断为肺结核；首次接受治疗者；年龄>18岁；未合并其他传染病病原合并感染者，如乙肝、艾滋病等。

排除标准：合并慢性阻塞性肺疾病、糖尿病或恶性肿瘤者；合并慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等其他慢性感染；近3个月内使用过糖皮质激素、免疫抑制剂等药物；妊娠期或哺乳期妇女；免疫功能障碍者。

三 实验方法

1 主要仪器及试剂

DW-86L626超低温冰箱(生产厂家：海尔特种电器有限公司)；L535R台式大容量冷冻离心机(生产厂家：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；美国Beckman Coulter公司生产的Epics XL型流式细胞仪；DD-5M低速大容量离心机(生产厂家：湖南湘立科学有限公司)；南京卡米洛生物工程有限公司生产的本研究所需的试剂盒；上海慧颖生物科技有限公司生产的PBS缓冲液；美国Santa Cruz公司生产的荧光抗体。

2 检测外周血Th1/Th2/Treg细胞及相应细胞因子水平

所有患者入院后均抽取空腹8h以上肘静脉血3～5mL，以3500 r/min离心15 min后提取血清50μ放入离心管，分离单个核细胞。采用FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司生产)测定Th1/Th2/Treg细胞比例：将细胞分为三份，CD4-FITC+IFN-γ-APC抗体标记Th1细胞，CD4-FITC+IL-4-cy5抗体标记Th2细胞，CD4-FITC+CD25-PE+Foxp3抗体标记Treg细胞，调整细胞浓度，将100 μL以上荧光抗体加入对应单个核细胞内，室内避光孵育1 h，冲洗(PBS缓冲液)，将破膜剂加入，再次避光孵育15 min，PBS冲洗后上机收集细胞流式细胞仪进行检测，检测过程严格按照其说明书进行操作。

Th1细胞因子IFN-γ、Th2细胞因子IL-4及Treg细胞因子IL-10均采用酶联免疫吸附试验进行检测，其操作过程需严格根据说明书进行操作。

3 数据分析

用Flow-Check标准荧光微球校正仪器光路，调整FITC/PE的荧光补偿，以CD4/IFN-γ、CD4/IL-4和CD4/CD25/Foxp3分别建立双参数直方图，得出CD4+/IFN-γ+、CD4+/IL-4+和CD4+/CD25+/Foxp3+的比例。

四、统计学方法

结 果

一、三组Th1细胞及相应细胞因子水平比较

与对照组相比，耐药组和无耐药组患者血清Th1细胞、IFN-γ水平均显著降低(tTh1=27.652、25.508，PTh1均<0.001；tIFN-γ=31.709、29.309，PIFN-γ均<0.001)，且耐药组患者血清Th1细胞、IFN-γ水平均显著低于无耐药组(tTh1=2.182，PTh1=0.031；tIFN-γ=2.781，PIFN-γ=0.006)(见表1)。

表1 三组Th1细胞及相应细胞因子水平比较

二、三组Th2细胞及相应细胞因子水平比较

与对照组相比，耐药组和无耐药组患者血清Th2细胞以及IL-4水平均显著降低(tTh1=29.457、18.881、17.227，PTh1均<0.001；tIL-4=31.741、16.838、14.995，PIL-4均<0.001)，且耐药组患者血清Th2细胞以及IL-4水平均显著低于无耐药组(tTh2=2.077，PTh2=0.041；tIL-4=2.333，PIL-4=0.022)(见表2)。

三、三组Treg细胞及相应细胞因子水平比较

与对照组相比，耐药组和无耐药组患者血清Treg细胞和IL-10水平均显著降低(tTreg=28.560、14.002，PTreg均<0.001；tIL-10=27.853、21.376，PIL-10均<0.001)，且耐药组患者血清Treg细胞和IL-10水平均显著低于无耐药组(tTreg=2.339，PTreg=0.022；tIL-10=3.395，PIL-10=0.001)(见表3)。

表2 三组Th2细胞及相应细胞因子水平比较

表3 三组Treg细胞及相应细胞因子水平比较

讨 论

据2016年世界卫生组织报告，我国耐多药肺结核发病率据全球第2位，复治肺结核患者具有明显的耐药性，同时耐药性也是结核病防治工作中急需解决的难点及重点问题[5-6]。耐多药肺结核诱因较多，患者免疫力降低是结核分枝杆菌感染的重要危险因素，且可增加结核分枝杆菌耐药性[7-8]。因此，通过分析耐多药肺结核患者免疫水平的变化情况，从而进一步探讨其对患者病情影响的的价值及意义，对该疾病的临床治疗尤为重要。

Th1/Th2型细胞因子在抗结核免疫中发挥重要作用，相关研究显示，耐多药结核的主要发病机制是患者外周血中Th1细胞和Th2细胞降低导致[9-10]。Th1细胞主要抗细胞内细菌及调节细胞免疫应答，可分泌IFN-γ等细胞因子，增加免疫应答[11]。Th2细胞可分泌白细胞介素IL-4、IL-5等细胞因子，对Th1细胞增殖具有抑制作用，介导体液免疫反应[12]。本研究结果显示，与对照组相比，耐药组和无耐药组患者血清Th1细胞及其细胞因子IFN-γ水平、Th2细胞及其细胞因子IL-4水平以及Treg细胞及其细胞因子IL-10水平均显著降低(P均<0.001)；耐药组患者血清Th1细胞及其细胞因子IFN-γ水平、Th2细胞及其细胞因子IL-4水平以及Treg细胞及其细胞因子TGF-β水平均较不耐药组患者显著降低(P均<0.05)，表明：耐药和无耐药结核患者免疫细胞水平均低于健康对照人群，而耐多药结核患者免疫细胞水平则较无耐药组患者更低，以上研究结果与前人研究结果一致。例如，刘凤娟[13]等学者通过研究提示，肺结核患者体内Th1细胞、IFN-γ水平及Th2细胞、IL-4水平明显低于正常人；余美玲[14]等研究提示，Thl型细胞因子与Th2型细胞因子水平可随肺结核患者病情变化增高或降低，病情越严重则其水平越低反之则相反。Miahipour[15]等研究提示，Th细胞亚群的失衡与耐多药肺结核的发生密切相关，特别是Th1细胞及其细胞因子降低。

Treg细胞是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群，对Th1等所介导的抗结核免疫应答具有仰止作用，当机体内Treg细胞及其相关因子不平衡时，会严重影响抗结核免疫应答，导致机体免疫功能受到抑制[16]。本研究结果提示，耐药组与无耐药组患者血清Treg细胞、IL-10水平明显低于健康组，并且以耐药组患者血清Treg细胞、IL-10水平最低(P>0.05)，提示结核病患者免疫功能明显受到抑制，而耐多药结核患者免疫抑制程度则比无耐药患者更为严重，与前人研究结果相似，如王国戗[17]等学者通过研究提示，在结核性胸膜炎患者体内Treg细胞水平明显降低，且低于正常人水平。另外本研究时间有限所纳入样本量较少，且随访时间较短，故进一步研究时，应在扩大样本量的同时对耐多药结核患者免疫细胞中的Th17细胞及其相关因子进行分析，且增加随访时间，深入研究论证。

总之，结核患者外周血中Th1细胞、IFN-γ，Th2细胞、IL-4以及Treg细胞、IL-10水平则高于健康人，特别是耐多药结核患者上述细胞因子变化更大，说明耐多药结核患者中免疫功能受损较为严重，Treg细胞及其细胞因子可能成为临床治疗耐多药结核患者的新方向。