谢景臣 谢五菊 王成存

近年来，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)发病率迅速增加[1]。尽管在诊断和治疗方面取得了进展，但NSCLC患者易出现复发或转移，如能早期治疗，患者5年生存率可达50%[2-4]。目前，临床诊断标志物是CEA，CYFRA21-1和SCC[5]。然而，这些肿瘤标志物往往不能提高早期诊断率。因此，寻找新的NSCLC标记物成为迫切的任务。微小RNA(miRNA)是一组内源性小和非编码RNA[6]，且在发育，分化，增殖和凋亡起着重要作用[7]。研究表明，miR-325-3p上调通过靶向HMGB1在NSCLC中抑制细胞侵袭和增殖[9-10]。此外，miRNA亦可作为肿瘤抑癌基因，并作为肿瘤启动子[11-12]。 然而，miR411在NSCLC中表达及其临床意义的研究较少。本研究通过探讨miR-411在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其表达与NSCLC临床病例特征和预后的关系，以期为NSCLC的诊断和治疗寻找新的分子靶点。

资料与方法

一、 一般资料

收集2017年3月至2018年8月于海南西部中心医院普二科行肺癌根治手术切除的非小细胞肺癌组织62例及其相应的癌旁组织。将人体组织在液氮中冷却并立即在-80℃冰箱中存储。所有患者均签署知情同意书及我院伦理委员会批准。

二、 实验仪器和试剂

实时荧光定量PCR(qPCR)仪，购于美国BioRad公司，Trizol Reagent购自于美国Invitrogen公司，总RNA提取试剂盒购自北京天根生化有限公司，反转录试剂盒购自美国Fermentas公司，SYBR Premix Ex Tap试剂盒购自日本TaKaRa公司，miR-411和内参β-actin引物均有上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。

三、实时荧光定量PCR检测miR-411相对表达量

从-80℃冰箱中取出预先保存的NSCLC样品及非肿瘤样品组织，Trizol法提取总RNA，用酶标仪测定RNA浓度和纯度，其中RNA纯度在19.～2.1之间。参照反转录试剂盒说明书，按照20 μl的反应体系进行反转录，合成cDNA。miR-411和内参β-actin cDNA实时荧光定量PCR反应体系均为10 μl，反应条件：95℃预变性30 s，95℃变形5 s，60℃退火1 min，40个循环。每个样本设置3个复孔，实验重复3次。以 2-△△Ct表示目的基因相对表达量。具体引物序列(见表1)。

表1 引物序列信息

四、统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行处理数据，计量资料采用±s表示，两组间比较采用t检验(独立样本t检验)，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较，方差齐性采用LSD法，方差不齐采用Games-Howell法，采用Graph Pad软件用于显示表达的分布情况，Cox回归模型分析影响总生存的因素。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、 miR-411表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

miR-411的表达与TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05)；与年龄、性别、肿瘤直径、组织学和有无吸烟史无关(P>0.05)(见表2)。

表2 miR-411表达与NSCLC临床病理特别的关系

二、非小细胞肺癌组织中miR-411表达

qPCR法检测miR411结果显示，非小细胞肺癌组织中miR-411表达水平为5.58±0.52，显著高于癌旁组织的1.64±0.38，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图1)。

图1 NSCLC组织和癌旁组织中miR411的表达情况

三、非小细胞肺癌预后分析

不同性别、年龄、有无吸烟史、肿瘤直径和组织学类型间非小细胞肺癌患者的OS差异无统计学意义(P>0.05)，而不同TNM分期、淋巴结转移否患者间的miR-411表达水平差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。

表3 NSCLC组织中不同临床病理参数的中位OS

四、影响NSCLC患者预后COX多因素分析

采用COX回归模型分析，结果显示，淋巴结转移(HR=1.698，95%CI：1.021～3.998)，TNM分期(HR=2.394，95%CI：1.289～4.221)及miR411(HR=1.447，95%CI：1.087～3.648)是影响预后的影响因素(P< 0.05)(见表4)。

表4 多因素COX回归模型分析

讨 论

肿瘤的发展是一个多阶段的缓慢过程，涉及广泛的分子生物学变化[13]。目前，已发现越来越多的肿瘤标志物在患者的组织中异常表达。早期研究报道表明，一些标志物可用于诊断和预测NSCLC的潜在生物标志物，如血清蛋白酶激活受体1[14]，糖基化α-1-酸性糖蛋白1[15]和血清HE4[16]。由于循环miRNA在2008年被发现[17]，它们迅速成为人类癌症诊断和预后的热点[18]。据报道，一些组织miRNA是肿瘤的潜在诊断和预后的生物标志物，例如宫颈癌的组织miR-20523[19]，肝细胞癌的组织miR-224[20]和骨肉瘤的组织miR-497[21]。

MiR-411在14q32编码并且属于14q32.31miR簇B[22]。以前的研究报道miR-411可能在肿瘤发生中起正或负作用。例如，Guo等[23]报道miR-411在乳腺癌中显著下调，miR411的过表达通过靶向特异性蛋白1显著抑制乳腺癌细胞的生长，迁移和侵袭。Xia等[24]发现异位表达 miR-411通过靶向ITCH表达促进人肝细胞癌细胞的增殖。上述结果表明miR-411在肝细胞癌和乳腺癌中起肿瘤抑制剂的作用。最近，Nadal等[22]报道miR-411表达在肺癌中显著上调。通过生存分析，他们发现具有较高miR-411表达水平的患者与较差的总体存活相关。此外，Zhao等[12]的另一项研究表明，miR411的过表达通过靶向肿瘤抑制基因FOXO1促进肺癌的细胞增殖。这些结果表明miR-411在NSCLC中充当肿瘤启动子。然而，迄今为止，尽管已报道了miR411的预后价值，但尚未报道NSCLC组织中miR-411的表达及早期诊断意义。在本研究中，我们利用RT-PCR法检测了NSCLC患者组织中miR-411的mRNA相对表达水平。我们的结果显示，NSCLC患者的组织miR411水平显著高于癌旁组织。接下来,我们分析了组织中miR-411表达与各种临床病理因素之间的关系，发现组织中miR-411的表达与TNM分期，淋巴结转移显着相关。提示组织中miR-411表达者与NSCLC发生、发展有关，miR-411高表达者可能与TNM分期较晚和伴有淋巴结转移。在预后方面，将miR-411表达≤3.21定义为低表达，>3.21定义为高表达。miR-411高表达者的中位OS>28个月，显著高于低表达者的22个月，差异具有统计学意义(P<0.05)。另外Cox单因素分析显示除miR-411表达外，淋巴结转移和TNM分期也与OS有关(P<0.05)。提示miR-411高表达、分期晚、伴有淋巴结转移者的OS差。研究显示miRNA和肺癌临床病理特征和预后有关，Wang等研究发现，miR-411与NSCLC的临床分期、病理分型有关[25]。此外，目前临床上关于miR-411和NSCLC的关系的研究少有报道，本研究结果表明miR-411的高表达可作为NSCLC的诊断，为后期预后预测提供新思路。

综上所述，miR-411在NSCLC中呈现高表达可作为诊断恶性程度预测的重要分子标志物，并且可作为后期深入研究的治疗NSCLC新靶点。