李青 周天慧 莫瑞东 项晓刚 赵刚德 周惠娟 徐玉敏 蔡伟 王晖 谢青 赖荣陶

药物性肝损伤(DILI)是指由各类处方或非处方的化学药物、生物制剂、传统中药(TCM)、天然药(NM)、保健品(HP)、膳食补充剂(DS)及其代谢产物乃至辅料等所诱发的肝损伤[1]。近年来，随着临床医师和公众对药物性肝损伤的重视和药物不良反应报告系统的日益完善，其病例报告数量正在逐年增加，其中约20%的药物性肝损伤病例发展为慢性化，并具有类似自身免疫性肝炎的临床表现。目前尚无鉴别DILI和AIH的特异性生物标记物，在临床上鉴别二者存在困难。两种疾病的治疗原则不同，寻找DILI早期预警信号对DILI临床诊断具有重要意义。

固有淋巴细胞(ILCs)是一群参与固有免疫的异质性淋巴细胞，介导局部免疫应答，发挥早期免疫监视和免疫调节作用。此外，ILCs 还可通过协调获得性免疫细胞的功能调节全身免疫应答[2]。 根据ILCs细胞表型和功能特点，可将ILCs 分为3类：ILC1、ILC2 以及ILC3。研究表明，ILC3与肝脏炎症疾病相关[3]，在HBV肝纤维化研究中，肝脏ILC3的活化促进肝星形细胞的活化，加重炎症损伤。在药物性肝损伤研究中，目前尚无关于ILC3细胞的研究报道，我们前期的研究结果显示，在药物性肝损伤患者的炎症反应中，患者肝内IL-22具有潜在保护效应。ILCs可分泌IL-22，本研究是基于我们前期的工作基础，监测药物性肝损伤患者外周血中ILC3的频数改变，为进一步阐明DILI的发病机制及筛选早期预警分子奠定基础。

资料和方法

一、研究对象

选取2019年1月至2019年6月上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科连续收治的DILI患者30例，AIH患者10例，健康对照(HC)10例。经瑞金医院伦理委员会批准，并征得患者同意，签署知情同意书，记录患者的临床资料及相关实验室检查结果，收集外周血，分离并保存血清。

药物性肝损伤患者的入组标准，参考 2015年中华医学会肝病学分会药物性肝病学组颁发的《药物性肝损伤诊治指南》，首次发现肝生化指标(ALT、AST、TBil、ALP等)异常7 d内；或撤除可疑药物后，肝生化指标反复异常6个月以上。AIH组纳入标准参考2015年中华医学会肝病学分会、中华医学会消化病学分会和中华医学会感染病学分会制订的《自身免疫性肝炎诊断和治疗共识》。

排除标准：各型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、原发性胆汁性胆管炎、肝豆状核变性、α1 抗胰蛋白酶缺乏症、血色病等各类肝胆疾病[4-5]。

二、临床资料采集

采集临床和实验室数据，包括年龄、性别、病史和血常规、肝功能等。

三、实验方法

分别留取各组患者外周血3 mL，采用Ficoll密度梯度离心法，获取外周血单个核细胞，经PBS洗涤，1 200 rpm/min离心5 min，弃上清，PBS重悬，配置40 μL细胞悬液，加入抗Lineage表面抗体，CD127-APC(17-1278-42，eBioscience)和PE-Cyanine7-NKP46(25-3359-42，eBioscience)流式荧光抗体混合液，进行膜表面分子。抗lineage包括如下抗体：CD3-FITC (35-0038-T100，Tonbo), CD19-FITC (35-0199-T100，Tonbo)，CD56-FITC(11-0566-42, eBioscience)，CD14(35-0149-T100,Tonbo)，HLA-DR(11-9952-42，eBioscience)，CD34-FITC (11-0349-42，eBioscience)，用于排除T、B、NK、单核、树突、造血干细胞和祖细胞，封闭相应FcγR，室温孵育20 min；分别加入1 mL PBS洗涤，1 200 rpm/min离心5 min，弃上清，加入200 μL含1%多聚甲醛的PBS重悬细胞，BECKMAN CytoFLEX 流式细胞仪检测外周血PBMC中Lin-CD127+NKP46+ILC3细胞频数。

四、统计学方法

使用SPSS 16.0软件和Graphpad 5.0软件分析处理数据。计量资料使用均值±标准误表示，两组间比较使用独立样本t检验或非参数检验，多组间比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA)或非参数检验。相关性分析采用Spearman相关法。P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、各组临床资料比较

30例DILI患者、10例AIH患者的临床数据纳入分析，另纳入健康对照(HC)组10例。各组间性别差异无统计学意义(P<0.01)，DILI组及AIH组患者的ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil水平均明显高于健康对照组(P<0. 01)，三组间PT及PLT差异无统计学意义。DILI组和AIH组间ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 健康人及各组患者一般情况及ILC、NKP46+ILC3比较

二、各组人群外周血PBMC中ILCs及NKP46+ILC3平均细胞频数百分比的比较

PBMC中ILCs平均细胞频数百分比在各组中存在差异。流式检测发现DILI组及AIH组中ILCs的细胞频数分别为0.060%±0.006%和0.074%±0.009%，均显著低于HC健康组(0.162%±0.015%，P<0.001)；DILI组和AIH组间的ILCs平均细胞频数百分比差异有统计学意义(P=0.03，见图1)。

PBMC中NKp46+ILC3的平均细胞频数百分比在各组中亦存在显著性差异，DILI组和AIH组的NKp46+ILC3平均细胞频数百分比分别为0.011%±0.002%和0.019%±0.004%，均显著低于HC健康组(0.041%±0.003%，P<0.001)；且DILI组的NKp46+ILC3的平均细胞频数百分比显著低于AIH组，差异有统计学意义(P<0.01)。随着患者各项肝功能指标的逐渐恢复，DILI组NKp46+ILC3平均细胞频数百分比也逐渐升高，AIH组NKp46+ILC3平均细胞频数百分比在治疗的相同时间段内无显著变化(图1)。

图1 各组人群外周血PBMC中ILCs及NKp46+ILC3平均细胞频数比较

三、ILCs及NKp46+ILC3随病情进展的相应变化

动态收集DILI组及AIH组的3例患者PBMC，检测患者入院7、14、28 d ILCs及NKp46+ILC3的细胞频数百分比。发现随着患者肝功能的逐渐恢复，DILI组的ILCs平均细胞频数百分比逐渐升高，而AIH组无显著变化。我们发现虽然DILI组ILCs总频数随着疾病的恢复而逐渐升高，但NKp46+ILC3在ILCs中的百分比基本不变， NKp46+ILC3在PBMC中的细胞频数百分比逐渐升高(图2)。

图2 DILI及AIH患者外周血中ILCs及NKp46+ILC3动态变化

四、NKp46+ILC3细胞频数与DILI患者肝功能指标的相关性分析

DILI患者NKp46+ILC3平均细胞频数百分比与天冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT),血小板(PLT)等肝功能水平无相关性(P>0.05)，与总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)呈负相关性(图3)。

图3 NKp46+ILC3细胞频数与DILI患者肝功能指标的相关性分析

讨 论

DILI与AIH因其临床表现类似，且多见于女性，两者血清学改变和病理学特征相近，一直是临床诊断的一大难题。又因两者的治疗原则不同，使得对其进行鉴别诊断尤为重要。当DILI患者存在自身免疫性特征时，通常需要对其进行肝脏活检，肝细胞胆汁淤积和汇管区中性粒细胞浸润提示DILI。在另一项研究中发现，DILI患者汇管区CD8+T细胞浸润明显，而AIH患者汇管区浸润主要为成熟B细胞[6-7]。

近年来的研究发现了一些诊断DILI的新型生物标志物，如高迁移率族蛋白1(HMGB1)、细胞凋亡指标keratin-18(cc)和细胞坏死指标keratin-18(FL)、与肝损伤相关的miR-122、miR-192，线粒体损伤标志物

GLDH、线粒体DNA、HLA基因多态性等，然而这些生物标记物是否可运用到临床有待进一步临床研究证实[8]。ILCs是一类新近发现、具有与辅助性T细胞相似表型和功能的“镜像细胞”, 但缺乏T、B细胞的抗原特异性受体。作为IL-22的主要来源，ILC3具有组织修复、重塑及维持组织内环境稳定的功能。ILCs是分泌效应细胞因子IL-22、IL-17、IFNγ、IL-5、IL-13的主要细胞，参与组织的修复以及防御病原体的入侵。在正常微环境中，ILC3s表达量较少，但能维持内环境稳定；当组织遭到损害时，ILCs迅速启动免疫应答，ILC3s表达量增加，分泌IL-22、IL-17及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，发挥组织保护作用并启动修复功能[9]。

我们前期工作发现IL-22在药物性肝损伤(DILI)及慢性乙型肝炎中发挥肝保护效应，但目前尚无ILCs在DILI中的研究报道[10]。新近的研究成果提示ILC3细胞及其分泌的IL-22在肝纤维化、类风湿性关节炎、炎症性肠病等多种疾病进展中发挥重要作用[11]。在本研究中发现，DILI患者外周血NKp46+ILC3细胞频数显著低于AIH患者。虽然DILI患者发病早期的氨基转氨酶、总胆红素等肝功能指标的高低与ILCs及NKp46+ILC3的细胞频数无相关性，但随着肝功能的逐渐恢复，外周血NKp46+ILC3频数亦逐渐升高，而AIH患者无显著性改变，表明在急性肝损伤后，NKp46+ILC3细胞频数可能发挥肝细胞再生、修复作用，而在慢性自身免疫性肝病中，肝细胞修复能力较弱。本研究的一大限制是动态分析的患者例数较少，异质性大，需扩大样本进一步比较。综上所述，外周血NKp46+ILC3细胞频数在DILI和AIH患者中存在差异，将来有关NKp46+ILC3在DILI中的临床诊断价值有待于更大样本量的多中心临床研究予验证。