何珺珺，时 伟，李 喆，甘广东

（茅台学院 酿酒工程系，贵州 仁怀564501）

白酒作为我国传统蒸馏酒，2019年产量达到785.95万kL。白酒在生产过程中产生大量的酒糟，研究发现，白酒与酒糟的产量比为1∶3[1]，预计2019年我国白酒酒糟的年产量可达到约2.4×107t。酒糟作为酿酒产业副产物，其中含有很多未被利用的粗淀粉、粗蛋白、粗脂肪及有机酸类物质。酒糟中粗淀粉含量为6.77%，粗蛋白含量为13.28%，粗脂肪含量为2.51%[2]。酒糟产量大，酸度高，其生化需氧量约为25 000～35 000 mg/L，化学需氧量约为35 000～50 000 mg/L，如果处理或利用不当，易腐烂、变质、发臭，造成环境污染和资源浪费[3-4]。如何高效利用酒糟是各白酒企业一直在探索的问题。目前，酒糟再利用的常见方法有生产饲料、作为菌菇类生长载体、生产有机肥、生产沼气、酿造食用醋、提取蛋白酶等[5-6]。传统的酒糟利用方法存在附加值低、预处理能耗高、二次污染等问题[7]。利用微生物处理酒糟以生产高附加值产品（如植酸、丁二酸、洛伐他汀等），有利于提高酒糟的利用价值和增加酒糟循环利用的经济效益[8-9]。

洛伐他汀是一种聚酮类物质，有两种结构形态，分别为酸型和内酯型，两种形态可相互转化[10-11]。其对胆固醇合成限速酶-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）具有高效抑制作用，从而具有抑制胆固醇合成，控制高血脂的功效[12-13]。还具有保护内皮祖细胞、抗血栓、抑制肿瘤细胞增殖等功能[14]。微生物来源的洛伐他汀主要以红曲霉或土曲霉为菌种，大米、小米、大豆、青稞、黄精渣、花生、甘蔗渣等为培养基采用固态或液态法发酵生产[15-16]。目前，利用红曲菌生产洛伐他汀的方法主要有固态发酵法和液态发酵法[17]。传统固态发酵法使用的基质为大米[18]，其中洛伐他汀的含量可达到14.54 mg/g。也有科研工作者以甘薯、木薯为基质生产洛伐他汀[19-20]。

为了研究红曲霉发酵酒糟制备洛伐他汀的效果，该研究采用固态发酵法，以茅台酱香型白酒酒糟作为基质，以红曲霉为菌种，并利用响应面法对发酵工艺进行优化，降低了生产成本，有效利用了白酒工业酿造副产物。1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌种

酱香型白酒酒糟：茅台集团；红色红曲霉（Monascns ruber）CICC 41649：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基

活化培养基[21]：5°Bé麦芽汁1 L，琼脂15 g，pH自然。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培养基：土豆（去皮）200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

种子培养基[22]：葡萄糖60 g/L，蛋白胨25 g/L，NaNO32 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L。

发酵培养基[23]：干酒糟（含水量12%）84%，麸皮15%，硫酸铵0.5%，KH2PO40.2%，MnSO40.1%，ZnSO40.2%，混匀，调整初始含水量为40%。

以上培养基均在121 ℃条件下灭菌30 min。

1.1.3 试剂

洛伐他汀（纯度≥98%）：美国Sigma公司；琼脂、葡萄糖、蛋白胨（均为生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；硫酸铵、NaNO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、MnSO4、ZnSO4、磷酸（均为分析纯）：成都科隆化工试剂厂；乙腈（色谱纯）：美国DIMA公司。

1.2 仪器与设备

PYX-XHS-40J电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；LS-B50L高压蒸汽灭菌锅：上海医用核子仪器厂；Waterse2695高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）仪：美国Waters公司。

1.3 试验方法

1.3.1 红曲霉固态发酵酒糟

将4 ℃保藏菌种接种到PDA斜面培养基，30 ℃恒温培养3 d。挑取孢子接种于种子培养基内，30 ℃、120 r/min振荡培养3 d作为种子液。

将种子液按20%接种量接种于发酵培养基，装料量20 g/500 mL，30 ℃条件下培养3 d后，25 ℃培养20 d，每3 d扣瓶一次。

1.3.2 红曲霉固态发酵酒糟产洛伐他汀工艺优化单因素试验

采用单因素轮换法，依次考察培养基装料量（20g/500mL、40 g/500 mL、60 g/500 mL、80 g/500 mL、100 g/500 mL）、接种量（12%、16%、20%、24%、28%、32%）、培养基初始含水量（40%、45%、50%、55%、60%）、分段发酵温度（22 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、发酵时间（5～21 d）对红曲霉产洛伐他汀的影响。

1.3.3 红曲霉固态发酵酒糟产洛伐他汀工艺优化响应面试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理及姜冰洁[24]的研究，选择装料量（A）、接种量（B）、初始含水量（C）为自变量，以洛伐他汀产量（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件进行3因素3水平的响应面优化试验，Box-Behnken试验因素与水平见表1。

表1 红曲霉固态发酵酒糟产洛伐他汀工艺优化Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for process optimization of lovastatin production from distillers' grains by solid-state fermentation of Monascus

1.3.4 洛伐他汀含量检测方法

发酵样品预处理：取发酵样品70～80 ℃烘干后研磨过筛，取0.5 g于50 mL容量瓶中，用体积分数为70%的乙醇定容至50 mL，55 ℃水浴超声萃取1 h，待测液经有机滤膜过滤后，取上清液，采用HPLC法测定洛伐他汀含量[25]。

HPLC条件：AthenaC18-WP色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温（30±0.5）℃，流动相为乙腈∶0.1%磷酸溶液=65∶35（V/V），流速1.0 mL/min，检测波长238 nm。根据洛伐他汀标准品的保留时间进行定性，外标法定量。

1.3.5 数据处理

采用Origin 7.5进行数据统计，SPSS 23.0和Design-Expert 8.0.6进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 红曲霉固态发酵酒糟产洛伐他汀工艺优化单因素试验

2.1.1 培养基装料量对洛伐他汀产量的影响

培养基装料量对红曲霉固态发酵产洛伐他汀的影响见图1。

图1 装料量对洛伐他汀产量的影响Fig. 1 Effect of charge on lovastain production

装料量对物料发酵具有重要影响，装料量太多影响通气，不利于红曲霉孢子丝的生长，同时造成培养基的浪费。装料量太少不能满足红曲霉生长繁殖的营养需要。由图1可知，随着装料量的增加，洛伐他汀产量呈现先增加后减少的趋势，当装料量为40 g/500 mL时，洛伐他汀产量达到最大，为5.573 mg/g。当装料量＞40 g/500 mL后，随着装料量的增加，洛伐他汀产量反而降低。原因可能是红曲霉在代谢过程中产生的热量影响红曲霉的次级代谢；也有可能是通气性较差，影响红曲霉的生长和繁殖。因此，确定培养基最佳装料量为40 g/500 mL。

2.1.2 接种量对洛伐他汀产量的影响

接种量对红曲霉固态发酵酒糟产洛伐他汀的影响见图2。

图2 接种量对洛伐他汀产量的影响Fig. 2 Effect of inoculum on lovastain production

由图2可知，随着接种量的增加，洛伐他汀产量呈现先增加后减少的趋势。当接种量＜24%时，洛伐他汀产量随着接种量的增加而增加，原因可能是红曲霉孢子生长速度快，代谢活动旺盛。当接种量为24%时，洛伐他汀产量达到最大值，为6.247 mg/g。当接种量＞24%时，随着接种量的增加，洛伐他汀产量下降，原因可能是接种量过大，有限的营养物质被用于供给红曲霉孢子的生长，不利于次级代谢和洛伐他汀的合成。因此，确定最佳接种量为24%。

2.1.3 培养基初始含水量对洛伐他汀产量的影响

培养基初始含水量对红曲霉固态发酵酒糟产洛伐他汀的影响见图3。

图3 初始含水量对洛伐他汀产量的影响Fig. 3 Effect of initial water contents on lovastain production

水对微生物的代谢活动有较大影响，初始含水量是影响红曲霉固态发酵的重要因素之一，含水量太低，培养基干燥、松散，不利于菌体的生长；含水量太高，培养基易结块，不利于红曲霉代谢。由图3可知，随着培养基初始含水量的增加，洛伐他汀产量先增加后减少，当初始含水量为55%时，洛伐他汀产量达到最大值，为6.527 mg/g。因此，确定最佳初始含水量为55%。

2.1.4 发酵温度对洛伐他汀产量的影响

发酵温度对红曲霉固态发酵酒糟产洛伐他汀的影响见图4。

图4 发酵温度对洛伐他汀产量的影响Fig. 4 Effect of fermentation temperature on lovastain production

由图4可知，发酵温度对洛伐他汀产量有较大影响，红曲霉经过30 ℃培养3 d后，在变温培养过程中，随着温度的升高，洛伐他汀产量先增加后减少，当发酵温度为28 ℃时，洛伐他汀产量最高，为6.687 mg/g。因此，确定红曲霉最佳发酵温度为28 ℃。

2.1.5 发酵时间对洛伐他汀产量的影响

发酵时间对红曲霉固态发酵酒糟产洛伐他汀的影响见图5。

图5 发酵时间对洛伐他汀产量的影响Fig. 5 Effect of fermentation time on lovastain production

洛伐他汀的产量是一个积累的过程。由图5可知，从发酵第5天开始，洛伐他汀产量快速增加；发酵10 d后，洛伐他汀产量的增长速度变慢；发酵17 d时，洛伐他汀产量达到峰值，为6.777 mg/g；发酵17 d以后，洛伐他汀产量减少。因此，确定洛伐他汀的最佳培养时间为17 d。

2.2 红曲霉固态发酵酒糟产洛伐他汀工艺优化响应面试验

2.2.1 模型的建立及方差分析

在单因素试验的基础上，确定分段发酵温度28 ℃、发酵时间17 d，选择影响较大的因素培养基装料量（A）、接种量（B）、初始含水量（C）3个因素为变量，洛伐他汀产量（Y）为响应值，进行3因素3水平的响应面分析试验，试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert8.0.6软件对表2的试验结果进行二次线性回归拟合，得到多元二次回归方程：Y=6.80+0.71A+0.66B+0.68C+0.31AB+0.13AC+0.021BC-1.97A2-2.32B2-1.79C2。

由表3可知，回归模型的P值＜0.000 1，极显著，失拟项P值=0.065 8，不显著，说明所构建的模型合适。该模型的校正决定系数R2Adj=0.980 4，表示能较好地预测实际发酵情况，可用该模型来预测红曲霉发酵酒糟制备洛伐他汀。一次项A、B、C及二次项A2、B2、C2对洛伐他汀产量的影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。通过F值可知，3个因素对洛伐他汀产量影响的主次顺序为A＞C＞B，即装料量＞初始含水量＞接种量。

2.2.2 响应面分析

利用Design-Expert8.0.6软件得到装料量、初始含水量及接种量间交互作用的响应面和等高线，结果见图6。

图6 各因素间交互作用对洛伐他汀产量影响的响应面及等高线Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on lovastain production

由图6可知，接种量、装料量和初始含水量3个因素之间两两交互作用的响应曲面呈凸面，说明存在最高点；等高线趋于圆形，说明这些因素之间的交互作用不显著。从等高线图中轴向等高线变化密集程度可知，装料量对洛伐他汀产量的影响＞初始含水量，接种量对洛伐他汀产量的影响最小，与方差分析结果一致。

2.2.3 最优发酵工艺的确定及验证

通过对回归方程进行分析，响应面优化红曲霉固态发酵酒糟制备洛伐他汀的最优条件为装料量44.90 g/500 mL，接种量24.51%，初始含水量56.05%，在此条件下30 ℃发酵3d后，28℃发酵17d，洛伐他汀产量的理论值达到6.981mg/g。考虑到实际操作可行性，将最优发酵工艺修订为装液量45 g/500 mL，接种量25%，初始含水量56%。在此最优发酵工艺下进行重复验证试验，洛伐他汀产量实际值为（6.97±0.05）mg/g，与预测值接近，证明响应面优化得到的发酵工艺条件合理可靠。

3 结论

本研究采用红曲霉固态发酵酒糟生产洛伐他汀，在单因素试验的基础上，通过响应面试验优化得到红曲霉发酵酒糟制备洛伐他汀的最优条件为装料量45 g/500 mL，接种量25%，初始含水量56%，分段发酵温度28 ℃，发酵时间17 d，在此优化条件下，洛伐他汀产量为（6.97±0.05）mg/g，是优化前的1.3倍。本研究为酒糟等工业废弃物的资源化利用提供参考。