体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）技术是目前施行心内直视手术的必备条件和保障措施。急性肺损伤是CPB 术后最常见的并发症之一。肺泡表面活性因子（pulmonary surfactant，PS）[1]是主要由肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌合成的脂质成分为主及表面活性蛋白（surfactant associated proteins，SP）为辅的复合活性物质，在体外循环时低通气量、低灌注血量、部分肺泡萎陷、通气血流比例失调均会导致肺泡表面活性因子代谢障碍。目前发现肺泡表面活性因子的含量与肺泡功能及免疫屏障相关。

在体外循环过程中肺组织需经受低血流量灌注、红细胞稀释、乏氧状态、血浆渗透压降低、平流灌注等多项非生理环境的刺激，尤其是婴幼儿未成熟的肺组织耐受能力差，术后更易出现急性肺损伤，严重者出现急性呼吸窘迫综合征，需要再次气管插管或待机延长，影响患儿预后[2]。因此选择一种能够预防性应用的干预措施以减轻CPB 相关肺损伤是目前研究的热点，而盐酸戊乙奎醚针对肺表面活性因子的保护作用及机制目前研究较少。本研究在实验中建立体外循环肺损伤大鼠模型[3]，通过预处理的给药方式探讨盐酸戊乙奎醚针对肺表面活性因子的保护作用及机制，为临床应用该类药物提供动物实验模型及理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组选择成年（12～18月龄）健康SD大鼠（350～400g）30 只，由新乡医学院动物实验中心提供[许可证号：XXSYXK（豫）2019-001139；动物合格证号：0132478791]，按随机数字表法分为3组（n=10）：对照组（Control 组）、体外循环组（CPB组）、盐酸戊乙奎醚预处理组（PHC 组）。

1.2 实验设备与材料小动物呼吸机（上海玉研仪器公司），体外循环血泵及配套硅胶管（polystanA/S，Denmark），变温器（西京医疗器械公司），18G、24G静脉留置针（安通医疗器械公司），动脉压力换能器（河南驼人医疗器械公司），微量泵（武汉科尔达医疗科技有限公司），动脉血气分析仪及配套试管（美国强生公司）；IL-6/10 ELISA 试剂盒（上海笃玛生物科技有限公司），SP-A/D ELISA 试剂盒（焦作路非凡生物科技有限公司），盐酸戊乙奎醚注射液（成都力思特制药股份有限公司），SP-B 一抗（上海瑞齐生物科技有限公司），SP-C 一抗（上海恪敏生物科技有限公司），山羊抗鼠二抗（艾美捷科技有限公司），PBS 粉（北京雷根生物技术有限公司），硫酸鱼精蛋白（青岛康原药业有限公司），肝素钠注射液（上海源叶生物有限公司）。

1.3 体外循环模型建立各组大鼠应用10%乌拉坦8ml/kg 腹腔注射麻醉，大鼠取仰卧位固定于动物实验台，游离颈部正中，分离气管、左侧颈动脉、右侧颈外静脉，气管切开插自制气管插管，全身肝素化，24G 带侧孔套管针穿刺右侧静脉并送入右心房作为静脉引流，24G 套管针穿刺入左侧颈动脉作为动脉灌注。游离左侧股动、静脉，分别置入持续动脉检测针与微量注射泵。全血凝固时间超过480s 后开始转流，并逐步降温至32℃，灌注流量逐步增加至80～100ml·kg-1·min-1，动脉压维持在60～80mmHg。血流检测稳定后，于左侧第4 肋间进胸分离阻断左侧肺门60min。开放后行循环15～20min，并复温至37℃后停止体外循环。停机前经颈动脉插管应用鱼精蛋白中和肝素，拔除CPB管道，经尾静脉回输机血。PHC 组于体外循环转流前30min 泵入PHC 2ml/kg，Control 组与CPB 组泵入等量生理盐水。

1.4 检测指标分别在体外循环前30min（T0）、体外循环术后1h（T1）、4h（T2）、8h（T3）时间点抽取血样3ml 行血气分析，计算氧合指数（OI）和呼吸指数（RI）；严格按ELISA 试剂盒要求检测血液中SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 水平；于T3 时间点取血后处死大鼠，取部分肺组织用免疫组化染色法检测SP-B、SP-C 蛋白表达。将左肺组织于10%磷酸福尔马林固定，不同浓度酒精洗涤、脱水、石蜡包埋，切4μm 的蜡带，45℃温箱烤片12h 后二甲苯脱蜡水化，加入柠檬酸缓冲液抗原修复，加入3%H2O237℃孵育10min，阻断内源性过氧化物酶，10%山羊血清37℃封闭孵育20min，滴加SP-B、SP-C 一抗，37℃孵育6h 后PBS 冲洗3 次，开始滴加辣根标记的羊抗兔IgG 二抗孵育20min 后PBS 冲洗3 次，滴加二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB）显色液并于显微镜下观察，显色满意后终止染色。显微镜下高倍镜（×400）视野拍照，细胞膜、细胞质呈棕黄、褐色反应代表抗原的定位，用Image-Pro Plus7.0 图像分析软件对照片进行测量分析。

1.5 统计学方法采用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示；多样本均数间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠OI 和RI 比较与Control 组相比，CPB 组、PHC 组大鼠在T1～T3 时间点OI 均下降，RI 均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。PHC 组大鼠在T1～T3 时间点OI 均高于CPB 组，RI 低于CPB组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 水平比较与Control 组相比，CPB 组、PHC 组大鼠在T1～T3时间点SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。与CPB 组相比，PHC 组大鼠在T1～T3 时间点IL-6 降低，IL-10 升高，在T2、T3 时间点SP-A、SP-D 均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠肺组织SP-B、SP-C 表达水平比较与Control 组相比，CPB 组、PHC 组大鼠SP-B、SP-C蛋白在胞浆中表达不连续，阳性表达较Control 组明显下降，SP-B、SP-C 蛋白的平均光密度值较Control组减少。与CPB 组相比，PHC 组大鼠SP-B、SP-C蛋白在胞浆中表达连续性增加，阳性表达增多，SP-B、SP-C 蛋白的平均光密度值较CPB 组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表1 各组大鼠OI、RI 比较（±s，n=10）

表1 各组大鼠OI、RI 比较（±s，n=10）

注：与Control 组相比，*P＜0.05；与CPB 组相比，ΔP＜0.05

指标 组别 T0 T1 T2 T3 OI Control 组 446.4±18.7 412.9±19.3 428.4±19.5 432.5±18.9 CPB 组 446.5±20.2 313.4±16.8* 284.2±18.6* 215.8±15.5*PHC 组 447.2±21.1 383.3±18.3*Δ 312.7±21.5*Δ 237.6±16.3*Δ RI Control 组 0.424±0.052 0.512±0.054 0.546±0.043 0.499±0.037 CPB 组 0.425±0.052 2.116±0.072* 2.785±0.034* 2.458±0.033*PHC 组 0.427±0.043 1.811±0.063*Δ 2.415±0.074*Δ 2.053±0.054*Δ

表2 各组大鼠SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 水平比较（±s，pg/ml）

表2 各组大鼠SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 水平比较（±s，pg/ml）

注：与Control 组相比，*P＜0.05；与CPB 组相比，ΔP＜0.05

指标 组别 T0 T1 T2 T3 SP-A Control 组 9.80±0.71 10.20±0.71 11.30±0.71 10.80±0.71 CPB 组 9.88±0.67 44.18±6.37* 107.81±11.38* 92.81±12.77*PHC 组 9.71±0.74 Control 组 14.20±0.88 CPB 组 13.98±0.87 42.29±6.87* 70.28±8.54*Δ 61.63±9.57*Δ SP-D 15.50±0.88 16.20±0.97 15.20±0.98 64.66±7.37* 184.34±9.54* 147.13±13.78*PHC 组 14.11±0.90 62.87±8.49* 168.52±10.63*Δ 135.48±14.55*Δ IL-6 Control 组 44.90±5.41 65.89±5.32 70.91±6.66 55.10±6.81 CPB 组 43.88±5.37 126.92±7.55* 210.87±8.79* 141.29±6.57*PHC 组 45.11±5.87 97.38±6.56*Δ 177.62±7.39*Δ 121.33±6.48*Δ IL-10 Control 组 66.13±5.33 93.68±7.54 121.77±8.44 113.65±8.87 CPB 组 66.25±5.02 110.59±7.66* 141.69±10.17* 133.72±9.17*PHC 组 67.82±5.64 173.85±7.10*Δ 206.54±12.92*Δ 157.56±11.28*Δ

表3 各组大鼠肺组织SP-B、SP-C 表达水平比较（±s，n=10）

表3 各组大鼠肺组织SP-B、SP-C 表达水平比较（±s，n=10）

注：与Control 组相比，*P＜0.05；与CPB 组相比，ΔP＜0.05

组别 SP-B SP-C Control 组 1.45±0.12 1.53±0.11 CPB 组 0.89±0.08* 0.95±0.08*PHC 组 1.02±0.09*Δ 1.18±0.10*Δ

3 讨论

体外循环过程中人为改变心肺灌注方式导致血液成分、血流动力学的剧烈改变，诱发全身炎症反应，而肺组织是对应激反应最敏感的器官之一[4]。 体外循环术后肺泡上皮细胞和血管内皮细胞破坏导致肺毛细血管通透性增加、细胞内外液分布失衡、肺组织水肿，造成通气功能障碍[5]。因此心内直视手术后的肺组织保护措施成为目前的研究焦点。

RI 和OI 能消除FiO2的影响并且早于PA-aO2反映肺内气体交换和氧合状态，是反映急性肺损伤严重程度的敏感和可靠指标[6]。IL-6 是白细胞介素家族中反映组织早期损伤的关键指标，是引起放大联级反应的中继因子，为介导炎性因子瀑布样释放的始动因素。IL-10 是抑制抗原细胞提呈和炎性因子释放的对抗性因子，是组织损伤的保护性因子，是机体对炎性反应的免疫抑制和抗炎的效应 因子[7]。

肺表面活性物质由80%的卵磷脂质和8%～ 10%的肺泡表面活性蛋白（SP）组成。SP 共分为4 种蛋白，其中包括SP-A、SP-D 亲水性蛋白和SP-B、SP-C疏水性蛋白[1]。本研究结果显示，CPB 组IL-6、 IL-10 于T1 时间点开始升高，T2 时间点达到峰值，T3 时间点缓慢回落，而SP-A、SP-D 则在T2 时间点开始升高并达到释放顶峰，T3 时间点缓慢回落。SP-A、SP-D 正常状态下多存在于肺泡上皮细胞内，血液中含量非常少，当肺泡上皮细胞破坏，SP 代谢失衡，SP-A、SP-D 释放入血引起血浆SP-A、SP-D浓度升高。研究发现SP 在外周血中增多是因为肺泡表面上皮细胞受损引起血管通透性增高，诱发SP-A、SP-D 透过受损的血气屏障进入血液[8]。蒋光辉等[9]发现SP-D 亲水性更强，血浆浓度更高，是Ⅱ型肺泡上皮细胞通透性增高的标志物。SP-B、SP-C 是肺泡血气屏障的支撑蛋白，主要分布于肺泡表面，形成疏水的磷脂-蛋白质层，维持肺泡表面张力，实现呼吸的通气、换气功能。研究发现[10，11]，带有SP-B、SP-C 基因缺陷的小鼠出生后很快就因呼吸衰竭死亡，表明SP-B、SP-C 是SP 所有蛋白中维持正常呼吸功能起着关键作用的支撑蛋白。

盐酸戊乙奎醚是我国自主研发的抗胆碱能受体阻滞药。现有研究表明，PHC 在脓毒血症诱发的急性肺损伤中能够通过多种分子通道发挥抑制白细胞介素释放、稳定细胞膜、改善毛细血管通透性、减轻肺组织损伤的作用[12，13]。但关于其对肺泡表面活性蛋白的影响目前研究较少，本研究通过对比各组SP-A、SP-D 在外周血中水平发现，PHC 能显著抑制大鼠肺组织SP-A、SP-D 释放入血，免疫组化染色结果显示，PHC 能够稳定SP-B、SP-C 蛋白的状态与活性，维持肺泡上皮细胞表面磷脂-蛋白质层的完整性，改善大鼠肺泡表面活性因子的代谢。

综上所述，PHC 预处理能够通过抑制炎性因子释放减轻肺损伤，其机制与抑制肺泡表面活性蛋白A、D 转移入血，保护肺泡表面活性蛋白B、C 活性，维持肺泡结构及改善肺泡张力有关。