李昌泽，华叶婧，王婧雯，周正，赵登宇，隋宏书

(1.山东第一医科大学临床医学专业，山东 泰安；2.山东第一医科大学组织学与胚胎学教研室，山东 泰安)

0 引言

睾丸的血供结构缺少吻合网且不容易代偿性扩张，因此特别容易受到缺血性损伤，严重时可见睾丸萎缩、睾丸功能等损害[1]。I/R 最初是由缺血引起，然后血供恢复再灌注可诱导进一步的损伤。由于无氧代谢和乳酸积累细胞内 pH 值下降，细胞肿胀、破裂、坏死、凋亡和自噬等。再灌注后氧水平恢复，活性氧生成激增，中性粒细胞浸润缺血组织，加重缺血性损伤[2]。在严重的缺血再灌注损伤中，ROS 的优势是压倒性的。以往的研究表明，过量的氧自由基和炎症反应被认为是睾丸 I/R 的主要原因[3]。

氢(Hydrogen，H)是一种无色、无臭、无味、无毒的非金属气体。氢分子作为一种选择性抗氧化物质。在很多 I/R 模型治中展现了良好的治疗效果。氢的生物抗氧化作用有非常鲜明的优点[4]。氢的还原性比较弱，可以与氧化作用很强的ROS 直接发生反应，与 OH-反应生成水，多余的氢可通过呼吸排出体外，这是氢选择性抗氧化的基础[5]。氢的制备容易，价格低廉。因此，作为一种抗氧化物质，氧具有选择性、无毒、无残留、简便价廉等诸多优点，具有很强的临床应用价值[6]。

1 材料与方法

1.1 实验动物

1月龄雄性清洁级SD大鼠(Hartley)，体重100～150g，购自济南金丰实验动物有限公司。动物房保持12h光照—黑暗循环，通风良好，室温维持在23～26℃。本实验动物饲养等程序均严格遵守执行国家《实验动物管理条例》中的各项标准和伦理指南。

1.2 主要试验试剂和仪器

富氢水(实验室制备)、MDA检测盒、SOD检测、大鼠TNF- a酶联免疫分析试剂盒(上海广瑞生物科技有限公司)、大鼠IL-6酶联免疫分析试剂盒(上海广瑞生物科技有限公司)、大鼠IL-1酶联免疫分析试剂盒(上海广瑞生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 手术方法随机分组后，按照40mg/kg戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉。麻醉成功后，在大鼠右下腹处做1～2cm，用镊子进入腹腔寻找睾丸及精索等结构。假手术组：将游离睾丸随意拨动几次后用生理盐水湿纱布覆盖睾丸，暴露90min缝合，观察6h后处死取右侧睾丸。生理盐水对照组：将游离的睾丸顺时针扭转720。用手术线将睾丸固定在肉膜组织，防止睾丸扭转复位，90min后扭转复位并缝合，注射生理盐水，观察6h后处死取右侧睾丸。氢分子治疗组：将游离的睾丸顺时针扭转720。用手术线将睾丸固定在肉膜组织，防止睾丸扭转复位，90min后扭转复位并缝合，注射富氢水，观察6h后处死取右侧睾丸。

1.3.2 HE染色观察睾丸组织形态

处死大鼠后收集右侧睾丸，将睾丸放置10%中性甲醛溶液中固定24～36h。固定后用酒精梯度脱水，后二甲苯透明石蜡包埋，在睾丸上中下三个部位做5μm 的连续切片，切片采用HE染色。在光镜下进行观察，使用Johnson评级法评估睾丸损伤。

1.3.3 MDA和SOD

称取各组睾丸质量后，制备的组织匀浆。根据MDA和SOD试剂盒说明书标准操作测量两者含量。

1.3.4 IL-1、IL-6、TNF-α

严格按照试剂盒说明进行操作，测量得到曲线方程。

1.3.5 凋亡指数测量

严格按照凋亡指数测量试剂盒检测，得到各个标本检测值。

1.4 统计学分析

每次实验至少重复3次，实验数据的处理均由SPSS 17.0软件分析，数据以(mean±SEM)表示。多样本间的数据比较采用单因素方差分析，多重比较使用LSD方法。如果数据不符合单因素方差分析的条件，则采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 HE染色

假手术组各标本结构清晰、细胞排列正常，生精小管和生精细胞未被破坏；生理盐水组和氢分子治疗组与假手术相比，损伤十分明显，睾丸组织结构混乱、层次不清和生精细胞破坏严重；氢分子治疗组的组织结构较生理盐水组相比，组织结构紊乱有一定改善，炎症细胞数量减少。通过组织损伤评级可以得出氢分子治疗组得到了一定的保护作用。

2.2 SODMDA

假手术生理盐水组氢分子治疗组

MDA检测结果得出，生理盐水对照组和氢分子治疗组较假手术对照组相比MDA含量增高明显；氢分子治疗组MDA含量有一定下降。SOD中氢分子比生理盐水对照组的表达水平增加，见表1。

表1

2.3 IL-1、IL-6、TNF-α

细胞因子(IL-1 IL-6 TNF- a)含量比较。

经过各组的睾丸标本匀浆检测。其中生理盐水对照组表达水平最高，氢分子治疗组的表达水平有一定降低，但与假手术组对照相比二者表达含量都明显增高。说明两组睾丸标本都已经发生严重的缺血再灌注损伤，氢分子并不能完全阻断炎症反应发生，但在一定程度上具有缓解炎症和保护组织作用，见表2。

3 讨论

氢分子可以在形态学上维持睾丸组织，但不能完全组织损伤的发生；通过降低过氧化物浓度和增加抗氧化物活性，从而降低体内氧化应激损伤作用；前炎症因子的检测发现，氢分子降低炎症反应的发生；氢分子的明显抗凋亡作用也能缓解缺血再灌注损伤后组织凋亡的发生。综上所述，氢分子在睾丸缺血再灌注损伤多种保护作用，值得我们进一步的深入探究。随着研究不断进行，对于氢分子在缺血再灌注损伤治疗中提供新的方向和基础理论。

表2