张楠 陈建波

摘  要： 在体外模拟人体生理环境，采用光谱法并结合分子对接技术，研究了安普那韦与人血清白蛋白（HSA）之间的相互作用.荧光光谱表明：安普那韦可以增强HSA的荧光强度.通过对结合常数和热力学常数的计算可知，安普那韦和HSA之间的作用力主要是疏水和静电作用力;紫外-可见光谱显示：安普那韦能够增加HSA的吸收峰强度，表明两者之间发生了相互作用.三维荧光光谱也显示：加入安普那韦后，HSA的斯托克斯位移从62 nm增加到了86 nm，说明安普那韦可以使HSA的微环境极性增加，疏水性减弱;从圆二色光谱的研究结果可知：随着安普那韦的加入，HSA的α-螺旋结构含量从18.38%增加到了63.62%，说明安普那韦的存在改变了HSA的二级结构.分子对接研究结果表明：安普那韦与HSA的作用位点位于HSA的ⅡA结构域，而同步荧光光谱的分析进一步证明了这一点.研究结果为进一步研究安普那韦在体内与血清白蛋白的相互作用提供了一定的理论参考.

关键词： 人血清白蛋白（HSA）; 安普那韦; 相互作用; 光谱法; 分子对接

中图分类号： R 915    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2020）04-0398-07

Abstract： The interaction between Amprenavir and human serum albumin （HSA） was studied by spectrophotometry combined with molecular docking technology under the conditions of simulating human body environment in vitro.The results of fluorescence spectrometry showed that Amprenavir enhanced the fluorescence intensity of HSA.And the calculation of binding constants and thermodynamic constants proved the existence of hydrophobic forces and electrostatic forces.UV-Vis spectra indicated that the absorption intensity of Amprenavir-HSA was gradually increased，which suggests that there was interaction between Amprenavir and HSA.The change of Stokes shift was observed from 62 nm to 86 nm through three-dimensional spectra，which indicated that Amprenavir increased the polarity and decreased the hydrophobicity of HSAs microenvironment.Circular dichroism was used to calculate the content of α-helix structure of HSA as well.Results showed that α-helix structure increased from 18.38% to 63.62% after the addition of Amprenavir.It proved that the interaction between Amprenavir and HSA changed the secondary structure of the protein.The result of molecular docking study suggested that the interaction between Amprenavir and HSA mainly occurred at ⅡA domain of HSA.This was further confirmed by the analysis of synchronous fluorescence spectrometry.This research provided a theoretical reference for further studies of Amprenavir in vivo.

Key words： human serum albumin （HSA）; Amprenavir; interaction; spectrometry; molecular docking

0  引  言

人类免疫缺陷病毒（HIV）是一种以核糖核酸（RNA）为遗传物质的艾滋病病毒，根据血清的分型，可将HIV分为Ⅰ型（HIV-1）和Ⅱ型（HIV-2）两种类型.艾滋病又名获得性免疫缺陷综合症，其感染性强、潜伏期长，是一种危害极大的传染病.安普那韦具有一定的抗HIV-1和HIV-2蛋白酶的作用，通过阻断HIV成熟所必需的蛋白质前体的分裂，来干扰病毒的生长过程，然后释放出没有成熟的、不具有传染性的HIV病毒分子.如果长期地服用安普那韦，可以降低血液中的HIV的负荷，降低感染艾滋病的机率，对于延长生命，提高生活质量有一定的辅助作用[1-2].

人血清白蛋白（HSA）是人体血浆中含量最丰富的蛋白质，具有特殊的配体结合能力，能与外源、内源物质相结合，对于药物分子转运到被吸收部位以发挥效力有重要作用[3-5].近年来，有很多学者对HSA和小分子药物的相互作用进行了研究.孙晓悦等[6]利用光谱法结合分子对接技术研究发现：呋喃西林可以静态猝灭HSA的固有荧光，且两者的相互作用位点在HSA的ⅢA亚结构域.PRAGNA等[7]利用荧光光譜法、红外光谱法、圆二色谱法等研究了2，4-二乙酰基间苯三酚动态猝灭HSA的固有荧光，改变HSA的二级结构.研究HSA和药物分子的相互作用对于了解药物在人体内的转运、分布、代谢以及作用机制等药代动力学具有一定的参考价值[8].

目前，已有很多学者对于安普那韦的合成进行了相应的研究，但是尚未有人对安普那韦和HSA在人体内外的相互作用机制进行研究.对于药物分子而言，它们在体内的分布与代谢主要取决于他们是否能和人体中主要的转运蛋白HSA结合.目前为止，安普那韦与HSA的结合常数、结合位点数和作用位点尚未明确.本研究通过荧光光谱法，检测安普那韦与HSA的相互结合，经计算得到结合常数和结合位点数等有关两者相互作用的参数;利用紫外-可见光谱法及圆二色谱法，研究了两者之间的相互作用对HSA结构的影响;还通过分子对接技术，预测了安普那韦与HSA之间的相互作用位点，并且结合同步荧光光谱法对分子对接预测的位点进行相应的验证，对于研究安普那韦在人体内的转运、分布、代谢，和对人体的作用机制以及艾滋病的治疗具有一定的参考作用.

1  材料与方法

1.1 实验材料

Cary Eclipse荧光分光光度计（美国Varian公司）;TU-1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）;J-815型圆二色谱仪（JASCO公司）;HSA（纯度大于98.0%），上海源叶;安普那韦（纯度大于98.0%），上海源叶;所用其他试剂均为分析纯.

1.2 实验方法

用pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶液配制HSA贮备液（1.0×10-4 mol?L-1）;用乙醇配制安普那韦贮备液（1.0×10-3 mol?L-1），置于4 ℃冰箱保存备用.在300～500 nm波段内扫描荧光光谱图，设置激发波长为280 nm，发射与激发狭缝为5 nm;从蛋白质数据库（PDB）获得HSA的晶体结构（PDB ID：1H9Z），采用Autodock 2.5软件进行分子对接.

2  结果与讨论

2.1 安普那韦与HSA的荧光光谱

HSA的荧光主要来自色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），但是由于Phe含量比较低，Tyr的荧光在被离子化时几乎被猝灭，因此HSA的固有荧光主要来自位于ⅡA疏水亚域的Trp 214残基.当药物与HSA发生相互作用时，Trp的环境的改变导致HSA的荧光强度有所改变[9].

根据表1所示，安普那韦与HSA的结合常数K比较大，说明两者之间通过结合发生了相互作用;ΔG<0说明安普那韦与HSA的反应可自发进行;ΔS>0，ΔH<0说明两者之間的作用力主要是疏水和静电作用力[10].

2.2 安普那韦与HSA的紫外-可见光谱

在紫外-可见吸收光谱中，由于电子跃迁，HSA会有两个特征的吸收带.如图2所示，随着安普那韦的增加，HSA的两个特征吸收峰的吸收强度逐渐增强，表明HSA与安普那韦发生了相互作用.

2.3 安普那韦与HSA的三维荧光光谱

图3（a）是HSA的三维荧光光谱图，图3（b）为安普那韦加入后HSA的三维荧光光谱图.由图3可知：随着安普那韦的加入，HSA的两个峰的强度都有所增加，具体的峰值变化如表2所示.其中λex为激发波长，λem为发射波长，F为荧光强度.

由表2可知：在加入安普那韦之后，峰1和峰2的强度都有所增加，其中峰2的荧光强度增加较为明显;峰2的斯托克斯位移从62 nm增加到86 nm，表明安普那韦的加入可使HSA的氨基酸的微环境极性增加，疏水性减弱[11].

2.4 安普那韦与HSA的圆二色谱

在圆二色光谱（CD）图中，由于电子跃迁，HSA会在208 nm和222 nm处出现的两个α-螺旋结构的特征吸收峰[12-14]，如图4所示.安普那韦加入后使HSA在208 nm及220 nm处的负槽减小，通过计算得出：当HSA与安普那韦之间的摩尔比为1∶0，1∶5和1∶10时，HSA中的α-螺旋结构在HSA二级结构元件数量的占比分别为18.38%，50.94%和63.62%，表明安普那韦与HSA的相互作用使HSA中的α-螺旋结构含量增加，改变了HSA的二级结构.

2.5 安普那韦与HSA体系的分子对接

分子对接是一种预测药物结构的主要工具[15]，本文作者利用分子模拟技术来预测蛋白质和药物之间的作用位点和结合区域.Lys199和Arg222位于HSA的IIA结构域[16].如图5所示，分子对接结果得到安普那韦与HSA的相互作用主要发生在Lys199和Arg222之间，可以预测安普那韦与HSA的相互作用主要发生在的ⅡA区域.

2.6 安普那韦与HSA的同步荧光光谱

图6中，当Δλ=15 nm时，酪氨酸荧光强度随安普那韦浓度的增加而降低;而当?λ=60 nm时，色氨酸的荧光强度随安普那韦浓度的增加而升高.在两者的同步光谱图中，色氨酸的同步荧光光谱与图1的荧光光谱的趋势相符，说明了安普那韦与HSA的相互作用主要发生在色氨酸附近[17].同时也表明了两者作用位点主要位于ⅡA区域，与分子对接的预测相符.

3  结  论

本文作者通过光谱法结合分子模拟技术，研究了安普那韦与HSA之间的结合常数、结合位点数、相互作用力以及相互作用位点等，为安普那韦在人体内的转运、分布和代谢提供了一定的参考依据.荧光光谱表明安普那韦可以增加HSA的荧光强度;在298 K条件下的反应结合常数为2.44×107 L?mol-1，表明了安普那韦与HSA之间结合较为紧密;热力学参数说明两者之间的作用力主要是疏水和静电作用力.紫外-可见光谱显示安普那韦与HSA发生相互作用.三维荧光光谱的斯托克斯位移在加入安普那韦前后由62 nm增加到86 nm，说明安普那韦可以使HSA的极性增加，疏水性减弱.圆二色谱计算得到HSA的α螺旋从18.38%增加到63.62%，表明了安普那韦可以改变HSA的二级结构，使HSA的构象发生变化.用分子模拟技术预测了HSA与安普那韦之间的相互作用的位点主要位于HSA的ⅡA区域，并且通过同步荧光光谱证明了分子对接的预测，说明了安普那韦与HSA之间的相互作用位点主要位于HSA的ⅡA区域.

参考文献：

[1] CABBAR F，BERKAY T S，GONCA D C，et al.Dental patients knowledge and awareness about transmission ways of acquired immune deficiency syndrome （AIDS） [J].Journal of Istanbul University Faculty of Dentistry，2016，50：19-26.

[2] VERONESE L，RAUTAUREAU J B，GILLOTIN C，et al.Single-dose pharmacokinetics of Amprenavir，a human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitor，in subjects with normal or impaired hepatic function [J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2000，44（4）：821-826.

[3] MAURYA N，MAURYA J K，SINGH U K，et al.In vitro cytotoxicity and interaction of noscapine with human serum albumin：effect on structure and esterase activity of HSA [J].Mol Pharm，2019，16（3）：952-966.

[4] PARRAY M U D，MIR M U H，DOHARE N，et al.Effect of cationic gemini surfactant and its monomeric counterpart on the conformational stability and esterase activity of human serum albumin [J].Journal of Molecular Liquids，2018，260：65-77.

[5] FANALI G，MASI A D，TREZZA V，et al.Human serum albumin：from bench to bedside [J].Molecular Aspects of Medicine，2012，33（3）：209-290.

[6] 孫晓悦，毕淑云，吴鋆，等.光谱及分子对接法研究呋喃西林与HSA的相互作用 [J].分子科学学报（中英文版），2019（2）：141-147.

SUN X Y，BI S Y，WU J，et al.Study on the interaction between nitrofurazone and HSA by spectroscopy and molecular docking [J].Iournal of Molecular Science，2019（2）：141-147.

[7] LAKSHMI T P，MONDAL M，RAMADAS K，et al.Molecular interaction of 2，4-diacetylphloroglucinol （DAPG） with human serum albumin （HSA）：the spectroscopic，calorimetric and computational investigation [J].Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2017，183：90-102.

[8] 杨雾，易忠胜，杨露露，等.小分子与HSA相互作用研究方法的进展 [J].理化检验：化学分册，2016（11）：1352-1358.

YANG W，YI Z S，YANG L L，et al.Progress of methods on the study of interactions between samll-molecules and human serum albumin [J].Physical Testing and Chemical Analysis Part B：Chemical Analysis，2016（11）：1352-1358.

[9] CUI F，ZHANG Q，YAO X，et al.The investigation of the interaction between 5-Iodouracil and human serum albumin by spectroscopic and modeling methods and determination of protein by synchronous fluorescence technique [J].Pesticide Biochemistry and Physiology，2008，90（2）：126-134.

[10] ROSS P D，SUBRAMANIAN S.Thermodynamics of macromolecular association reactions：analysis of forces contributing to stabilization [J].Biophysical Journal，1980，32（1）：79-81.

[11] LU Z，QI L，LI G X，et al.In vitro characterization for human serum albumin binding Sorafenib，a multi kinase inhibitor：spectroscopic study [J].Journal of Solution Chemistry，2014，43（11）：2010-2025.

[12] WANG Y，WU P，ZHOU X，et al.Exploring the interaction between Picoplatin and human serum albumin：the effects on protein structure and activity [J].Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2016，162：611-618.

[13] POURESHGHI F，GHANDFOROUSHAN P，SAFARNEJAD A，et al.Interaction of an antiepileptic drug，Lamotrigine with human serum albumin （HSA）：application of spectroscopic techniques and molecular modeling methods [J].Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2016，166：187-192.

[14] MIR M U H，MAURYA J K，ALI S，et al.Molecular interaction of cationic gemini surfactant with bovine serum albumin：a spectroscopic and molecular docking study [J].Process Biochemistry，2014，49（4）：623-630.

[15] MORRIS G M，LIM-WILBY M.Molecular docking [J].Methods in Molecular Biology，2008，443：365-382.

[16] ASCENZI P，FASANO M.Allostery in a monomeric protein：the case of human serum albumin [J].Biophysical Chemistry，2010，148（1/2/3）：16-22.

[17] SIDDIQI M，NUSRAT S，ALAM P，et al.Investigating the site selective binding of Busulfan to human serum albumin：biophysical and molecular docking approaches [J].International Journal of Biological Macromolecules，2017，107：1414-1421.

（責任编辑：顾浩然）