陈丽霞, 赵志毅, 刘明霞, 李向军*

(1. 中国科学院大学化学科学学院, 北京 100049;2. 北京分子科学国家实验室, 北京大学化学与分子工程学院, 北京 100871)

毛细管电泳(CE)是20世纪80年代初发展起来的一类以高压电场为驱动力,毛细管为分离通道的新型分离分析技术,主要依靠各样品组分淌度和分配行为上的差异实现分离,是现代微柱分离和经典电泳技术相结合的产物。与传统色谱分离技术相比,CE具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、分离模式灵活多样等特点,尤其在进样量上,CE可达nL乃至fL级,比高相液相色谱(HPLC)等至少降低了3个数量级。基于这些优势,CE被广泛应用到环境、生物、食品、医药等多个研究领域[1-4]。

一个物体不能与其镜像相重合的特性被称为手性,具有这种特征的分子则为手性分子,手性现象广泛存在于自然界与生命体中。手性分子在非手性环境中理化性质基本一致,在手性环境中其生理活性却往往存在重大差异。基于此特性,将手性对映体分离并进行鉴定已成为分析领域一大研究热点,而CE凭借众多优势在分离过程中被广泛使用[5-8]。刘明霞等[9]已从手性拆分剂的选择和提高CE分离度的角度,对手性化合物的CE分离进行了综述。本文则从CE中手性化合物的定性检测方式角度,总结近年来CE手性化合物的分析进展。

1 依赖标准品的毛细管电泳分析

在CE分析,包括色谱分析中,未知样品中待测物的定性通常采用比较标准品迁移时间或标准加入法完成。检测可利用常见的紫外-可见(UV-vis)检测器通过毛细管窗口直接检测,也可通过荧光、电化学、质谱、核磁等其他检测器进行检测。不同检测模式对样品性质、前处理手段的要求不一,随之形成的图谱、适用范围及定性检测方式也各有不同。

1.1 光学检测

光学检测包括UV、激光诱导荧光(LIF)、化学发光(CL)等多种检测方式,其中UV检测器以性能稳定、结构简单、性价比高等优势在CE中应用最为广泛,是商品化CE固定的检测器之一。冯涛等[10]在220 nm波长下利用CE-UV成功分离并检测手性药物美托洛尔的对映体峰,通过与光学纯单一对映体标准品的迁移时间对照,确认了对映体峰的出峰顺序及位置。Pasquini课题组[11,12]先后以2-羟丙基-丙基环糊精和2,6-二-氧-甲基-β-环糊精为手性拆分剂,利用CE-UV在92份茶叶中完成了对儿茶素、甲基黄嘌呤和茶氨酸等成分的手性分离,并根据迁移时间完成了定性分析。Yao等[13]在210 nm的目标波长下,利用环糊精改性电动色谱快速分离测定大鼠眼眶静脉血浆中苯那敏对映体,同时结合大体积样品进样极性反转扫集(LVSS-PS)和阳离子选择性耗尽进样扫集(CSEI-PS)两种样品在线预富集方法,大大提高了实验灵敏度,而对映体出峰顺序和迁移时间不发生改变。不足之处是该检测器只适用于有紫外吸收信号的样品,无紫外吸收的情况下需对样品进行衍生化前处理,且毛细管内径窄、检测光程短,导致CE-UV检出限高,无法满足样品痕量检测需求。针对该问题,有研究者开发了多种特殊形状的检测池以增大毛细管的光程。Moring等[14]利用一种由石英球透镜改造的新型Z形池,将毛细管的光通量增强了3 mm,使仪器的信噪比和分辨率等都提高了至少一个数量级,更好地实现了物质的定性分析。

LIF检测器属于荧光检测器的一种,该类检测器检测通常采用辐射强度大、带宽窄、空间相干性强的激光作为激发源,光源与信号强度之间良好的线性关系及低背景、高信噪比等优势也使其成为众多CE检测器中灵敏度最高的一种检测方式。LIF检测有单维荧光和多维荧光两种检测方式,后者又由波长分辨、时间分辨和偏振荧光检测等模式构成,可大大提高信噪比与灵敏度,为物质的定性定量分析提供了全面的信息。李风雷[15]将5种手性氨基酸试剂分为两组,利用常规柱前衍生紫外检测和CE-LIF分别进行了分离检测,根据迁移时间定性的同时也验证了CE-LIF检测方法的优越性;Kirschner等[16]以磺化-β-环糊精为手性分离剂,建立并优化了CE-LIF手性拆分氰基[f]异吲哚(CBI)衍生物的方法,分离成功后对照标准品的迁移时间实现定性;Creamer等[17-19]以牛磺胆酸盐钠(STC)和γ-环糊精为双手性选择剂,5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)为衍生剂,利用胶束电动毛细管色谱-激光诱导荧光检测器(MEKC-LIF)分离鉴定了数十种天然手性氨基酸,并进一步将该方法应用于航空研究。目前,LIF检测器的检出限可低至10-9～10-13mol/L,灵敏度也已达到单细胞水平,充分满足了生物、环境等领域痕量检测的需求。不足之处是该检测器价格比较昂贵且样品需要有荧光信号,否则需要用异硫氰酸荧光素(FITC)[20]、4-氟-7-硝基-2, 1,3-苯并氧杂恶二唑(NBD-F)[21]和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)[22]等试剂进行衍生化,过程比较烦琐。

除了这两种检测器,光学类检测器还包括CL检测器[23]、拉曼光谱检测器[24]、傅立叶转换红外光谱检测器[25]等,该类检测器大多采用比较标准品迁移时间的方法实现未知样品定性。针对手性样品不同的性质和发光信号,利用CE进行分离分析时,可选择合适的检测器。由于适用范围广、检测类型多样且操作简单,光学检测器在CE检测中应用最为广泛。

1.2 质谱、核磁检测

CE-MS结合了CE分离速度快、样品用量少与MS高特异性、高灵敏度的优势,在一次分析中能同时得到样品的迁移时间、相对分子质量和离子碎片等定性信息,大大拓宽了二者本身的适用范围。在没有标准品的情况下,非手性物质可以通过CE-MS测定未知物相对分子质量等信息来完成定性检测,但由于手性分子相对分子质量完全相同,故质谱法在手性领域的应用通常也需依赖标准品,同时需要结合相对分子质量之外的其他信息。具体方法包括将其中一个对映异构体选择性地标记上同位素原子,通过质谱检测提供质量差异实现准确定性的主客体关联法[26,27];或是基于不同分子碰撞截面,根据离子大小、形状差异实现手性小分子分离鉴定的离子迁移质谱法[28,29]。其中,碰撞诱导非对映体解离法是近些年发展起来的一种快速高效的手性质谱分析方法,添加手性配体形成非对映异构体复合物是该分析方法的关键[30],根据数据分析方法的不同,该法又可分为动力学方法(KM)、固定配体动力学法和手性识别比法(CR)。Yu课题组[31]将具有手性选择性的色氨酸、脯氨酸等对映体小分子,与双核铜配体结合形成四聚体离子,建立了用于手性氨基酸分离鉴定的行波离子迁移质谱法。研究发现,色氨酸和组氨酸具有更好的对映选择性。Nagy等[32]通过合成NiⅡ/L-Asp/5’GMP和CuⅡ/L-Ser/5’GMP两种固定配体组合,结合碰撞诱导离解串联质谱法完成了12个戊糖异构体的完全鉴定和绝对构型测定。Karthikraj等[33]在ESI+条件下成功合成铜离子络合物的三聚体,与碘代氨基酸结合分离鉴定10种对映体药物的同时,采用反应动力学法和CR法还分别得到了10种药物的手性分化参考值。此外,CE-MS还有多种仪器联用方式。Schultz等[34]利用分流技术将CE与MS连接后,在全扫描条件下成功分离并检测到fmol级的20种手性氨基酸,利用得到的样品信息对其分别定性,并将该方法用于血液分析,准确鉴定了苯丙酮尿症和酪氨酸血症类的代谢类疾病。Svidrnoch等[35]以万古霉素作为手性拆分剂,应用毛细管电泳-串联质谱联用技术实现了药物中D,L-2-羟基戊二酸对映体的直接手性拆分,得到的电泳迁移时间及碎片离子质荷比等信息为分离后对映体定性提供了保证。而Sanchez-Hernandez等[36]以环糊精为手性选择物,通过优化两种毛细管电泳-串联质谱方法,测定了不同水解蛋白肥料中所含游离氨基酸的外消旋度,并由此识别了除半胱氨酸外所有蛋白质氨基酸。He课题组[37]首次将手性胶束电动色谱(CMEKC)与大气压光电离质谱(APPI-MS)实行在线耦合,并以此完成了4种光引发剂的对映体分离和在线定性检测。CE-MS在环境、医药、生物等领域应用较为广泛,但由于MS的定性检测同样需要标准品进行比较对照[38,39],且MS价格昂贵、操作复杂,一定程度上限制了该类检测器的使用与发展。

与CE-MS类似,CE与核磁共振波谱(NMR)结合,在保证高效分离效果的同时,也提供了手性样品的对映体结构等准确信息。Béni等[40]以环糊精为手性拆分剂、甲苯磺酰基和丹磺酰氯为紫外衍生化试剂,在4种pH条件下成功分离得到神经药物普瑞巴林的R-异构体,并利用二维旋转坐标系NOE核磁(2D ROESY NMR)技术得到异构体衍生物的核磁氢谱,结合电泳图的迁移时间完成了手性样品的定性分析。Kwon等[41]将琥珀酰聚糖单体(M1、M2、M3)作为手性添加剂,通过CE和13C NMR谱实现了对儿茶素的手性分离鉴定,结果表明,CE和NMR谱图中琥珀酰聚糖的琥珀酸取代基是分离鉴定手性儿茶素的决定性因素。该类方法高效准确,但用到的核磁共振仪器体积庞大、价格昂贵、维护成本高,应用范围较局限[42]。

1.3 电化学检测

根据分离模式不同,CE可归结为多种类型,如毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等速电泳(CITP)、MEKC等,电化学检测(ED)多与CZE模式联用。ED主要包括安培检测、电容检测和电位检测3种,其中电位检测由于灵敏度低，应用较少。安培检测由于灵敏度与选择性较好,在CE手性检测中应用较多。Wallingford和Ewing[43]最开始用碳纤维电极作为工作电极,Fang课题组[44,45]在此基础上尝试用铜电极、镍电极等成功测定了多羟基抗生素、单糖等手性分子的电离常数,并利用迁移时间实现了样品的定性分析。电导检测中的电容耦合非接触电导检测器(C4D)具有结构简单、成本低廉、电极不易污染等优点,广泛应用于手性分析,近些年发展较为迅速。Tuma等[46]应用CE-C4D快速检测了饮料、食品和食品添加剂中的葡萄糖和果糖等手性糖类化合物,通过逐步添加标准溶液,观察峰面积变化实现了多种样品的定性。Pormsila等[47]以万古霉素作手性拆分剂,利用CE-C4D分离鉴定了5种α-羟基酸阴离子和两种α氨基酸对映体,并进一步在牛奶和酸奶中检测出乳酸对映体。陈丽等[48]同样应用CE-C4D分离检测技术,在柠檬酸-Zn2+体系的电泳运行液中实现了异亮氨酸对映体的手性分离,通过对照标准品确认对映体出峰顺序的同时,对其手性识别机理也作了初步探讨。Costa等[49]将CE-C4D与CE-UV结合,在样品无需衍生化的前提下通过对照标准品的迁移时间,实现了药物中手性精氨酸、抗坏血酸和天冬氨酸的同时定性。CE-ED克服了毛细管检测光程短、灵敏度低等缺陷,在电活性物质检测、微流控芯片分析等领域应用广泛,不足之处是重现性较差,电信号不够稳定。

2 不依赖标准品的毛细管电泳分析

对于色谱分析来讲,缺乏标准品时,可通过制备色谱获得单一纯品后进行进一步分析或采用液相色谱-圆二色光谱(LC-CD)联用实现手性化合物对映体的定性分析[50,51],但由于毛细管进样量极少,单一对映体的标准品很难用CE制备得到。在对映体标准品缺乏的前提下,利用CE实现手性物质分离定性的方法主要有酶消解和抗体添加法、计算法等。

2.1 酶消解和抗体添加法

酶消解法是指在被测样品中加入相应的降解酶或氧化酶,通过观察峰面积的变化实现物质定性,该方法对手性和非手性物质均适用。Grimshaw等[52]利用睾丸透明质酸酶将人膝关节滑膜液中的聚合透明质酸水解成四糖,以欧乃派克造影剂为内标,通过CE测得的色谱峰实现了透明质酸的定性和基础定量分析。同样针对透明质酸,Hayase课题组[53]发现，将不同相对分子质量的支链淀粉作为缓冲液中的添加剂后,支链淀粉的浓度和相对分子质量均影响透明质酸样品的迁移时间,并根据样品相对分子质量的范围会造成色谱峰不同程度的展宽,对不同相对分子质量的透明质酸进行确认。人体中所含氨基酸大多为手性氨基酸,Patel等[54]在单个神经细胞提取液中添加了D-天冬氨酸的氧化酶,通过观察目标峰面积的变化,实现了物质的定性和构型的确认。此类方法主要根据目标物的对应酶进行判断,准确性很高,但由于大多物质不易获得专一消解酶,其应用范围较局限。

除酶外,抗体或其他蛋白质的结合作用同样适用于部分物质的定性分析。Sun课题组[55]以右旋糖酐作为牛血清蛋白(BSA)的缓冲液添加剂,通过调节右旋糖酐浓度控制BSA对样品结合力的强弱,用毛细管亲和电泳(ACE)分离了布洛芬、亚叶酸、亮氨酸和戊氨酸等手性物质,并指认了其对映体峰。Marie等[56]利用糖基化终产物(AGEs)特定的抗体,通过CZE与MS联用分离鉴定了天然、氧化类和糖化类人血清白蛋白(HSA)。此外,Lurie等[57]以2,6-吡啶二甲酸为显色试剂,建立了海洛因中葡萄糖、乳糖、蔗糖、肌醇和甘露醇的CE定性分析方法。这类方法的弊端是适用范围都较局限,所以在不依赖标准物的前提下,寻找新的CE中手性物质定性方法十分必要。

2.2 计算法

CD是手性光学技术中具有代表性的一种方法,其原理是利用手性化合物对左旋和右旋圆偏振光的吸收系数差异,测定二者吸收系数之差随波长变化所形成的光谱图,是手性化合物分析的重要方法[58]。在色谱分析中,通过色谱分离后再进行CD测定,或直接采用色谱-CD联用技术,可对手性物质对映体进行分析,但由于CE分析所需样品量极小,通过CE方法无法制备得到足够量的样品用于CD分析,同时CE中管径小,光程短,目前尚未见到商品化的CE-CD联用仪器。这使得在CE分析中,尤其对缺乏标准品且来源珍稀的手性对映体来说,CE样品用量少的特点并没有得到充分利用。

图 1 CE结合CD对三羟基天冬氨酸4种对映异构体实现峰确认[61]Fig. 1 Identification of four enantiomers of trihydroxy aspartic acid identified by CE binding circular dichroism (CD)[61]EHA: erythro-3-hydroxyaspartate; THA: threo-3-hydroxyaspartate; FMOC-Cl: 9-fluorenylmethyl chloroformate.

图 2 CE结合CD分离分析非消旋对映体混合物方法的流程图Fig. 2 Flow chart of method for separation and analysis of non-racemic enantiomer mixtures by CE and CDDFT: density functional theory; TDDFT: time-dependent density functional theory; ECD: electronic circular dichroism.

近年来,量子化学(QM)计算法发展迅猛,特别是含时密度泛函理论(TDDFT)这种契合了计算时间与精度的计算方法的出现,使得CD结合理论计算成为确定手性物质绝对构型的一种常用方法[59,60]。该方法通过对手性化合物的两种对映异构体进行CD计算,对比实验值与两种可能的对映异构体CD图谱的相似性,确定手性化合物的绝对构型。Liu等[61]以β-环糊精为手性拆分剂,9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl)为衍生剂,通过CE-MS建立了双手性神经递质分子3-羟基天冬氨酸4种立体异构体的分离方法,并利用理论计算结合实验圆二色谱的方法对4种异构体的色谱峰实现了峰确认(见图1)。同年该课题组[62]在此基础上明确了CE-CD分离分析流程(见图2),建立了不依赖光学纯标准品,CE结合CD分离鉴别对映体的方法,并以色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、丙氨酸、布洛芬、萘普生等7种手性化合物为例,验证了该方法的可靠性。

3 结论

目前,利用CE技术进行手性分离已成为一种常用手段,除新的手性拆分剂和分离模式层出不穷外,手性对映体出峰顺序的确认及物质定性等方面的研究也日益受到关注。以往发表的工作通常均需借助光学纯的单一对映体标准品实现定性;缺少标准品时,受体-配体等分子间作用力可为对映体提供选择性,但此类方法适用范围较局限。针对该问题,借助量子化学谱图模拟,将CE与CD结合,既可弥补单一实验分析的不足,更能深入探究手性分离机理、实现手性物质的准确快速定性。在以后的工作中,这种研究思路也将受到更多分析化学工作者的青睐。