王 芳, 王 松, 丛海林,2, 于 冰,2*

(1. 青岛大学生物医用材料与工程研究院, 青岛大学化学化工学院, 青岛大学附属医院, 山东 青岛 266071;2. 生物多糖纤维成形与生态纺织国家重点实验室, 青岛大学材料科学与工程学院, 山东 青岛 266071)

毛细管电泳(CE)是一种以毛细管柱作为分离通道,高压直流电作为驱动力,根据样品在系统中的迁移差异使各组分分离的分析技术。它具有分析效率高、分离时间短、分析范围广和样品用量少等优点[1]。电泳作为一种高效的分离技术,已实现与多种检测器联用,并开发出多种分离模式。将CE与高选择性及高灵敏度的质谱(MS)联用,不仅使系统的灵敏度显著提高,且弥补了CE在定性方面的缺陷[2]。毛细管电泳-质谱(CE-MS)联用技术作为一种高效的分离分析手段与液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术相辅相成,互为补充[3],可获得最高的代谢覆盖率,提高数据的准确性。

CE-MS技术已成为复杂基质和低浓度目标分析物的首选[4]。近几年来,CE-MS联用技术的相关研究层出不穷,主要包括新技术方法的设计、改进以及应用研究。Szigeti等[5]通过引入一种高效的样品前处理方法,对人血清N-糖基组学进行毛细管电泳与激光诱导荧光(CE-LIF)分析,并为电离模式下的CE-ESI-MS分析提供了条件。Wild等[6]通过多段进样-毛细管电泳-质谱(MSI-CE-MS)联用技术对苯丙酮尿症病人尿液和血浆的代谢物进行分析,以检测新的生物标记物。这项分析不仅可以对苯丙氨酸中毒进行检测,且为患者的健康饮食提供了指导。目前CE-MS越来越多地应用于生命科学、医学、药学等领域,已在蛋白质组学、代谢组学、生物标记物等方面取得重大进展[7]。本文就2015年来,CE-MS在技术改进和应用方面的发展进行了综述。

1 CE-MS技术改进

目前,联用系统仍存在接口不合适、电喷雾不稳定等问题,限制了该技术的发展。本节从涂层类型、接口技术和数据处理方法等方面介绍了CE-MS的发展。

1.1 毛细管涂层

在进行分析时,分析物与毛细管壁的相互作用会对分离效率、电渗流(EOF)和迁移时间造成影响,降低系统的分离效果。涂层可有效解决分析物在毛细管内壁的吸附问题,但在CE-MS中,并非所有涂层都适合与MS系统兼容。MS要求涂层不干扰其检测系统,若涂料进入质谱仪会引起严重的背景噪声,降低分析物信号,污染光学器件[8]。基于此,只有稳定的静态涂层可满足要求,涂层的应用提高了联用系统的分离性能,使系统更具分析优势。

在CE-MS分析中,EOF的稳定性影响样品分析的灵敏度与重现性。稳定的CE-MS接口需要具有朝向毛细管出口的EOF,否则鞘液或空气会被吸入毛细管中,导致系统电流不稳定,甚至出现运行故障[9]。EOF与电喷雾的形成有关,对分离过程及质谱检测都有一定的影响。这意味着CE-MS在选择合适的毛细管涂层时须考虑到EOF的相关特性。

3种类型的涂层都是通过降低分析物与毛细管壁间的相互作用来提高分离效果。带电的毛细管涂层可以改变CE-MS中EOF的方向和大小,阴离子涂层在分析阴离子样品时占优势,阳离子涂层可形成较高的EOF,若将其应用于无鞘接口中,可通过延长毛细管来提高其分辨率。中性涂层对分析物的电荷没有限制且可显著降低EOF,因此在CE-MS中应用最广。

作者课题组以光敏性重氮树脂(DR)为偶联剂,通过自组装构建出多种共价键合的涂层毛细管柱(包括聚乙烯醇型(PVA)[10]、聚乙二醇型(PEG)[11]、环糊精型(CD)[12]、羧基化富勒烯型(C60-COOH)[13]),并对它们进行了蛋白质分离性能的研究。这类涂层通过抑制毛细管对蛋白质的吸附实现了蛋白质混合样品的基线分离,不仅提高了CE的分离性能,而且表现出良好的稳定性和重复性。最近,作者团队又设计了一种环境响应型的共聚物毛细管涂层,聚合物能够根据温度、pH等参数的变化调整链段构象和聚集形态,来去除毛细管涂层上特异性或非特异性吸附的蛋白质,最终实现涂层的自清洁性能,并探索其在蛋白质、多肽电泳分析和质谱联用技术等方面的应用。

Acunha等[14]合成了一系列由阳离子N,N,N′,N′-四乙基二亚三胺(TEDETAMA)和中性N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)组成的聚合物链用作毛细管涂层。实验表明物质的量比为50∶50的TEDETAMA-co-HPMA共聚物涂层具有良好的EOF稳定性和CE-MS兼容性,可有效地分离碱性蛋白质/肽的标准混合物和16种阴离子代谢混合物,分离效率高、重复性好[15]。通过分析奶酪样品中的溶菌酶以及橙汁和葡萄酒中的阴离子代谢物证明了该CE-MS涂层在蛋白质分析和代谢物分析方面的可行性。

1.2 接口技术

CE-MS联用技术中离子源的选择对分析结果至关重要,常见的离子源包括适用于非极性小分子的电子轰击(EI)、适用于极性较弱的化合物的大气压化学电离(APCI)、适应于极性分子的电喷雾电离(ESI)、适用于大分子分析的基质辅助激光电离(MALDI)以及可实时分析、样品无需处理的环境电离模式(DESI/DART)。其中ESI-MS在联用系统中应用最广,极性小分子至大分子均可分析。CE中的流速非常低,为了与MS实现联用,需要建立一个封闭的电路来维持CE分离所必需的高压[16]。目前根据鞘液的存在与否,CE-MS界面主要分为两大类:鞘液界面和无鞘界面。

1.2.1鞘液界面

在鞘液装置中,充当液体电极的导电液体被送到毛细管出口周围,提供闭合CE和ESI电路所需的电接触[17]。在进行电喷涂过程之前,样品和鞘液在毛细管尖端混合。尽管鞘液界面对背景电解质(BGE)和流速具有良好的耐受性[18],但空间稀释作用会增加系统噪声,最终使系统灵敏度降低。高流速鞘液的稀释作用被视为不利条件,而以纳米喷雾的流速输送该液体时可改善问题[19]。纳米喷雾(1 000 nL/min以下)可以完全依靠电喷雾来工作,喷雾通过电场作用于流动液体获得更小的液滴(低于200 nm)。在获得气相离子前,较少的裂变事件就可提高电喷雾过程的整体效率。相比于在高流速条件下形成微米级离子喷雾(1～1 000 μL/min),纳米喷雾流速呈现出与CE更高的相容性,因此可以改善界面的柔韧性以及电离问题[20]。除此之外,通过对鞘液接口进行改造,可有效减少死体积,提高灵敏度[21]。

Gonzalez-Ruiz课题组[22]开发了一种无雾化气体辅助的低鞘液CE-ESI-MS接口来减少分析物的稀释。通过对鞘液、工作距离和ESI电位等主要参数以及泰勒圆锥体尺寸的研究,该接口最终用于基础药物分析,并展现出良好的抗干扰性和结果可重复性。最近,他们通过减小毛细管与发射器间的距离,构建了一种样品分散最小化的新鞘液接口CE-ESI-MS[23]。对比前期工作,这种接口可有效提高信噪比,减小峰展宽(见图1)。通过药物分子和内源性代谢物的测试成功鉴定出与神经传递相关的物质。这一改进显著提高了样品在迁移时间、峰面积等方面的重现性,在复杂的生物样品分析中具有潜在的优势。

图 1 不同锥型接口所得的紫外(UV)与电喷雾电离(ESI)对比图Fig. 1 Comparison of ultraviolet (UV) and electrospray ionization (ESI) from different cone interfacesReproduced from Ref. [22] with permission.

1.2.2无鞘界面

鞘液界面的灵活性使其被更广泛的应用[24],但鞘液组成的多变性以及对样品的稀释也限制了该技术的发展。无鞘液接口可更有效地提高分析灵敏度,其产生的电喷雾最大限度地减少了稀释[25],保持检出限稳定。

无鞘界面在电喷雾和电接触方面缺乏稳定性,是限制其发展的主要原因[26]。无鞘界面通过在毛细管出口处使用金属或导电聚合物涂覆,或者将金属微电极引入毛细管形成闭合回路,以实现所需要的电接触[27]。在这样的界面中,电喷雾的唯一成分是BGE本身,因此必须对其组分进行优化。与鞘液界面相比,无鞘界面的主要优势在于灵敏度高,同时保持了CE的优势。无鞘CE-MS的优势有利于有限样品的分析[28],并为组学研究提供了思路。

Petersen等[29]开发了一种简单且灵敏度高的无鞘CE-MS接口,此接口成本低且稳定性好。当该界面以低纳升流速(45～90 nL/min)对蛋白质/多肽样品进行分析时,不仅使药物蛋白(包括胰岛素、组织因子和α-突触核蛋白)有效分离,且可以对蛋白质异构体进行分析。

Hirayama等[30]在毛细管柱末端约2 cm处形成一个小裂缝,并将其覆盖在塑料板上固定,制成如图2a的CE-MS新型无鞘界面。在优化的分析条件下,该界面可分离出52种阳离子代谢物标准品,且与商业化毛细管兼容性好。与鞘流液界面相比,该界面具有更高的检测灵敏度和分析效率(如图2b),有望在代谢组学分析中发挥优势。

图 2 (a)无鞘CE-ESI-MS界面示意图与(b) CE-MS在不同界面下对代谢产物的分析Fig. 2 (a) Schematic of the sheathless CE-ESI-MS interface and (b) analysis of m/z of metabolites by CE-MS at different interfaces For Fig. 2a: 1. plastic plate; 2. electrodialysis membrane; 3. separation capillaries; 4. platinum electrodes; 5. buffer reservoirs. For Fig. 2b: black line, unsheathed; grey line, sheath flow. Reproduced from Ref. [30] with permission.

随着界面复杂性的提高[31],用户自己可以执行的维护任务已显著减少。在连接仪器时,兼容性受限的问题给用户带来极大困扰。因此,我们理想的CE-MS技术应包含以下特征[32], (i)不存在雾化气体稀释效应;(ii)减少鞘流液对BGE成分的电离依赖性;(iii)设计简单,易于实施和维护。未来的发展从这几个方面改进将会提高系统的抗干扰性和实验的可重复性。

1.3 数据处理方法

联用技术在设备和方法上的优化显著提高了其应用价值,但数据分析的方法也是至关重要的。一般来说受到背景电解质、电渗流和电喷雾的影响,CE-MS不易通过迁移时间准确地确定分析物[33],这导致结果灵敏度低,重现性差。因此需要一些分析技术来完善结果。

Gonzalez-Ruiz等[34]介绍了一种新的软件工具ROMANCE,可通过改善分析数据的稳定性来实现特征识别。ROMANCE的设计考虑了代谢组学研究的样本数量和数据大小。通过标准分析软件包进行处理,转换后的数据结果文件可以通过常规的代谢组学流水线处理(预处理,峰提取等)。它们几乎不需要运行对齐,也不需要校正面积,仅取决于所选BGE的性质和温度。通过标记EOF或电泳迁移率的峰,将CE-MS文件自动转换为以电泳迁移率为标度的信息,在不同实验室中进行对比。通过归一化过程来校正时标的偏移,即可轻松识峰,分析图见图3。该方法具有更高的重现性和可比性,降低了样品在不同条件下造成的保留时间差异。

图 3 一组标准化合物在不同分析平台上的迁移时间,迁移电泳率转化对比Fig. 3 Comparison of migration time and migration electrophoresis rate of a set of standard compounds on different analysis platforms Reproduced from Ref. [34] with permission.

Ortiz-Villanueva等[35]用知识集成策略(多元曲线分辨率与交替最小二乘法(MCR-ALS))对不可发酵碳源(乙酸)和发酵碳源(葡萄糖)中的酵母样品进行代谢组学数据分析。对CE-MS和LC-MS数据进行独立的MCR-ALS分析后获得的数据要少于先对两个平台的数据进行融合处理所得到的结果,先融合处理提供了更高的代谢物覆盖率,具有增强代谢物响应鉴定的作用。这种方法便于提取不同培养条件下的最相关特征,通过可视化代谢网络更好地理解生物系统的变化,解释生物学问题。

2 代谢组学

CE-MS联用技术是分析离子代谢物的有效工具,对复杂样本的研究具有前瞻性的价值。CE-MS对代谢组学/蛋白质组学的分析已用于许多临床问题,包括对肝损伤[36]、神经性疾病[37]、肾损伤[38]、肝脏药物代谢[39]或糖尿病[40]、心血管疾病[41]中相关分子的鉴定。

代谢组学是对小分子代谢产物进行分析,并从中分析出与疾病相关的特定代谢物作为生物标记物,它们可以直接反映生物系统中酶的活性,对临床疾病的预测和监控具有重要作用[42]。当涉及稀缺的生物样本分析时,CE-MS具有明显优势。

内源性代谢物代表各种小分子,而含胺的小分子(如氨基酸和神经递质)是生物体的基本组成和关键调节剂[43]。因此,研究生物体中胺的代谢产物对疾病的治疗和监测至关重要。Wells等[44]将预浓缩技术与CE-MS联用来分析生物样品中的生物胺。通过调整电动增压(EKS)与ESI-MS的方法参数,获得了最佳的分辨率、灵敏度以及与ESI-MS的相容性。用此方法对大鼠脑干和果蝇组织中的7种生物胺进行靶向分析,16 min内就实现了几种神经递质的基线分离。此外,通过样品预处理也可实现透析液等高离子强度样品的检测,这是将EKS与CE-ESI-MS/MS联合使用来分析生物样品的第一种方法。

CE-MS在细胞的定性和定量分析中具有潜在的应用价值。通过筛选细胞样品中的产物并对其定性定量分析,可以预见生物反应器的变化,为后续获得其他产物的定性提供依据[45]。例如在生物制药工业中,表征不同的变体,确定重组抗体的结构异质性,将有利于其功能性的发展[46]。

图 4 微探针取样与CE-ESI-MS联用对双离子代谢物进行分析Fig. 4 Microprobe sampling combined with CE-ESI-MS for analysis of dual ion metabolitesReproduced from Ref. [47] with permission.

Portero等[47]将微探针与CE-ESI-MS联用,对非洲爪蟾活胚的单细胞进行阴阳离子代谢物分析。用毛细管微采样器从活细胞中收集细胞材料,提取其中的阴离子和阳离子代谢产物并对其进行CE-MS分析,原理见图4。通过优化背景电解质提高痕量样品分析的灵敏度,对阴阳离子进行双重分析,更深入地覆盖了代谢网络。此方法可扩展至更小的细胞或其他类型的细胞和生物,为探究分子水平的细胞生物学奠定了基础。

Van Mever等[48]开发了一种用于分析哺乳动物细胞中的阴离子代谢产物的无鞘CE-MS新界面。但在后续的研究中发现,负离子分析模式下电晕放电可能会导致离子丰度降低和纳米ESI针头发射器寿命缩短。为解决这一问题,该研究组通过优化设计,在阳离子模式下成功分析了哺乳动物的酸性化合物(包括核苷酸)[49],完全规避了电晕放电,降低了检出限,提高了检测灵敏度,见图5。

Sanchez-Lopez课题组[50]用无鞘CE-MS对不同阶段多囊性肾脏的小鼠组织切片进行了代谢物分析,其中包括肉碱、谷氨酰胺、肌酸、甜菜碱和肌酸酐等代谢物。这项研究通过小鼠模拟人类疾病的发展变化,其高分离效率和低样品消耗等优势为受限样本在代谢分析和生物学中的研究提供了价值。

3 蛋白质组学

临床蛋白质组学的一个主要目标是改善疾病管理[51]。具有识别性的蛋白质或多肽在疾病发展过程中是至关重要的[52],它可以提供治疗的最佳机会。CE-MS可在检测过程中发挥重要作用[53],不仅可以有效分离,还可以准确确定结构,包括化合物的相对分子质量、氨基酸序列、各种翻译后的修饰或与其他化合物的相互作用等。蛋白质或肽的生物标志物组可以显著提高诊断的灵敏度。因此CE-MS既可用于生物标志物的鉴定,又可用于临床诊断的评估。

图 5 (a)阳离子模式下的CE-MS酸性化合物代谢谱分析与(b)样品预浓缩处理后核苷酸谱图Fig. 5 (a) Metabolic analysis of CE-MS acidic compounds in cation mode and (b) nucleotide profile after sample preconcentrationReproduced from Ref. [49] with permission.

CE-MS在蛋白质组学分析中的基本问题包括谱带展宽、分离效率差和数据重现性差等。多维分离技术[54]在复杂的样品分析中发挥越来越重要的作用。Jooss等[55]将反相液相色谱法与毛细管区带电泳-质谱(CZE-MS)结合,开发了一种新型的LC-CZE-MS装置。通过反向液相色谱法分离模型蛋白后进行CZE-MS分析以实现对不同糖基化蛋白质的细化分离,分析见图6。与一维分析方法相比,这种方法改善了分离能力,有效降低了检出限,有望解决其他各种分析难题。

图 6 用纳米LC-CZE-MS分析蛋白质混合物Fig. 6 Analysis of protein mix by nano-LC-CZE-MS The mix contained RNase B (100 μg/mL), cytochrome c (80 μg/mL), lysozyme c (80 μg/mL), and myoglobin (50 μg/mL). First dimension (a): nano-LC chromatogram (214 nm detection wavelength) of the separation of different proteins. Second dimension (b): CZE-MS electropherogram obtained after a heart-cut of RNase B peak (transfer volume: 20 nL).Reproduced from Ref. [55] with permission.

Nyssen研究组[56]开发出一种能够分离甲状旁腺激素(PTH)及其变体的无鞘CE-MS方法,并对这种蛋白质的标记物进行了定量分析。通过EKS装置对样品进行预浓缩,中性涂层毛细管、乙腈背景缓冲液来减少蛋白质与内壁的相互作用显著提高了检测灵敏度。这种无鞘CE-ESI-MS方法在低水平生物样品的分析中具有明显优势。

Bush等[57]用ESI无鞘接口与CZE-MS联用,完整分析了重组人干扰素-β1(一种在单个N连接位点具有复杂糖基化作用的生物药物)。使用交联的聚乙烯亚胺涂层解决了不同形式异构体的分离。将蛋白质分离技术与酶处理技术结合,促进了药物蛋白质的表征和分析[58]。

目前,诊断/监测疾病的方法是采用成像技术和侵袭性组织活检结合的方式。对于诊断性筛查,选择容易获得的体液(例如血清、血浆和尿液等)作为样本进行测试,可减少病人痛苦[59]。为了增加早期发现疾病的机会,非侵入性筛查测试已被引入临床实践并与CE-MS应用结合展现出良好的诊断潜力。

CE-MS结果中一种标记物可能与多种疾病/并发症的发展相关[60],这使预测、诊断和指导治疗包含了更多的标记物靶点。Belczacka课题组[61]对上千份癌症患者及对照组的尿液进行CE-MS分析,寻找可用于监测实体瘤的尿液生物标记物,从193种肿瘤特异性肽中选择3种来鉴定其变化与癌症发展的关系。纤维蛋白原衍生肽段水平升高与膀胱癌、肾细胞癌和胰腺癌相关;髓过氧化物酶(MPO)衍生肽的降低与胰腺癌、膀胱癌和胃癌的发展有关;黏蛋白肽(MUC16)的降低与胰腺癌、卵巢癌等癌症相关。同样地,对心脏疾病患者的尿液进行研究,鉴定出包括胶原蛋白片段的103例差异蛋白[62]。CE-MS通过数据对比获得的共有标记物为后续疾病的检测和治疗提供了新思路,可能成为最有潜力的分析方法。

Mischak等[63]研究了在药物开发和患者管理过程中应用生物标志物的作用,通过发现并发症、促进个性化药物治疗有效减少了患者的医疗成本,凸显了CE-MS在疾病诊断、分层治疗和药物开发分析中的优势。

4 结论

在过去几年中,大量研究证明了CE-MS在代谢组学/蛋白质组学中的实用性。但是缺乏标准的操作程序给数据的重复性研究造成诸多不便,在使用基于电泳迁移率的文库时,有效的电泳迁移率对鉴定生物样品中的代谢物具有很高的价值。当前,组学分析的主要瓶颈是鉴定那些在公共数据库中没有标准信息,但却具有生物学/临床研究意义的未知代谢物。因此,CE与MS耦合技术仍被科学界视为挑战。为了获得好的分析结果,未来CE-MS分析检测应朝以下3个方面发展:i)适当的样品制备和分离技术,以降低检出限、提高灵敏度;ii)开发合适的毛细管涂层和CE-MS接口技术,以确保分析的重现性和稳定性;iii)优化的临床研究和数据统计,以提高临床相关结果的准确性。