王美灵,黄亚楠,李敏敏,王艳芳,张潇文,张雷明

(烟台大学药学院,分子药理和药物评价教育部重点实验室(烟台大学),山东 烟台 264005)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种病因未明的自身免疫性疾病,关节滑膜炎为其主要特征,RA全球患病率为0.5%～1.0%,患病人数接近500万. 如何有效防治RA成为亟待解决的公共健康问题[1].目前抗RA药物有非甾体类抗炎药(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs),糖皮质激素(Glucocorticoid,GCs),慢作用抗风湿药(Disease modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs)等经典药物,也有以阿达木单抗(抗TNF-α)、妥珠单抗(IL-6受体拮抗剂)为代表的新型生物药. 其中NSAIDs和GCs在缓解关节肿胀、疼痛方面疗效确切,DMARDs可延缓RA病情进展. 但这3类药物长期使用存在胃溃疡、骨质疏松和免疫抑制等严重不良反应[2]. 以单克隆抗体为代表的生物药能有效抑制RA病情进展,但也存在易致机体感染、价格昂贵难以普及的缺点,而且约有30%的患者临床治疗无效[3].

人参是治疗RA的传统中药,人参皂苷是人参的主要活性成分,属于三萜皂苷类化合物[4]. 据报道,人参皂苷及其主要活性成分,如人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1(图1),对多种急性和慢性炎症疾病比如脓毒症、脑缺血、结肠炎和动脉粥样硬化都有广泛的保护作用. 研究表明,Rb1可以减轻LPS所致的大鼠肺损伤及小鼠急性炎症伤害感受和神经炎症[5-7],还能通过阻断JNK和p38信号通路减轻血管紧张素II诱导的小鼠腹主动脉瘤[8]. 然而,Rb1对RA的作用尚未见报道,因此,本研究旨在探讨Rb1对佐剂性关节炎(Adjuvant-induced arthritis,AIA)大鼠的作用及其机制,为传统中药人参的现代应用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物

Sprague-Dawley(SD)大鼠,雄性,体重160～180 g,由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供,动物许可证号: SCXK(鲁)20140007. 动物房温度23～25 ℃,相对湿度40%～60%,光照12 h,所有大鼠自由饮食饮水. 动物实验方案已获得烟台大学实验动物伦理委员会批准.

1.2 药品与试剂

小鼠RAW264.7细胞(ATCC TIB-71): 中科院上海细胞库提供; 人参皂苷Rb1(货号: GR1080,纯度≥98%): 南京广润生物制品有限公司提供; 地塞米松注射剂(批号: 41753-43-9): 辰欣药业股份有限公司提供; 弗氏完全佐剂(FCA,批号: 170334): 美国Chondrex公司提供; 大鼠TNF-α(H052)、IL-1β(H002)和IL-6(H007)ELISA试剂盒: 南京建成生物工程研究所提供; 小鼠TNF-α(F3602)、和IL-6(F3538)ELISA试剂盒: 上海西唐生物科技有限公司提供; IκBα(sc-74451)、p-IκBα(sc-74451)、p65(sc-71675)和p-p65(sc-52401)抗体: 美国Santa Cruz公司提供; 其他试剂均属分析级.

1.3 仪器

YLS-7B足趾容积测量仪(济南益延科技发展有限公司); 酶标仪(美国Molecular Devices公司); TGL-16G台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂); Western blot 电泳仪、转膜系统(Bio-Rad公司); 凝胶成像系统(日本GE生物科技公司).

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠AIA模型制备 于大鼠右后足足跖皮内注射0.1 mL FCA致炎,对照组于相同部位注射等量生理盐水. 造模当天设为第0天[9].

1.4.2 实验分组及给药 第14天,选择造模成功的大鼠随机分组,共分为6组:对照组、模型组、地塞米松2.5 mg/kg组、Rb1 5 mg/kg组、Rb1 10 mg/kg组和Rb1 20 mg/kg组. 分组完成后,按上述剂量腹腔注射给药,每天1次,共14 d.

地塞米松是临床上治疗RA的常用药物,且有研究表明其抗炎作用机制与NF-κB信号通路有关,因此本实验采用地塞米松为阳性对照.

1.4.3 关节炎评估 在第0、14、17、20、23和27天用足趾容积测量仪测定大鼠继发侧足趾容积,求关节肿胀度. 关节肿胀度=(致炎后容积-致炎前容积)/致炎前容积×100%. 并按照Wood法以0—4的等级评估关节炎: 0级: 无红肿; 1级: 足小趾关节红肿; 2级: 趾关节、足跖部均红肿; 3级: 踝关节以下均红肿; 4级: 包括踝关节,全部红肿. 每只大鼠2只后爪的累积得分作为关节炎指数[10].

1.4.4 关节组织病理学检测 第28天,将大鼠麻醉后,4%多聚甲醛心脏灌注,然后将其继发侧后肢自膝关节以上约3 cm处截断,去除皮肤,用4%多聚甲醛溶液固定和5%甲酸脱钙后进行石蜡包埋,切片进行HE染色,于光学显微镜下观察大鼠膝关节滑膜、软骨及骨组织病理学改变,并以0—4的等级进行评估[11].

1.4.5 血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平检测 第28天,将大鼠麻醉后,眼内眦取血,静置30 min后,离心(3 000 r/min,10 min)取血清. 采用ELISA法测定血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平.

1.4.6 胸腺和脾脏指数与组织病理学检测 第28 d,麻醉取血后处死大鼠. 迅速取胸腺和脾脏称重. 胸腺或脾脏指数=胸腺或脾脏湿重与大鼠体重的比值(mg/g). 然后对胸腺和脾脏固定、包埋、切片并进行HE染色.

1.4.7 细胞培养 RAW264.7细胞加入RPMI 1640培养基,将其置于5% CO2,37 ℃细胞培养箱中培养1～2 d.当细胞融合80%～90%时进行传代.

1.4.8 细胞上清NO、TNF-α和IL-6水平检测 细胞以105个/孔的密度接种于96孔板,培养24 h后,设定对照组、模型组、地塞米松50 nmol/L组及人参皂苷Rb1(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)组. 对照组给予DMSO,模型组给予1 μg/mL的LPS,给药组各孔中加入1 μg/mL的LPS和不同浓度的地塞米松或人参皂苷Rb1. 培养24 h后收集细胞上清液,Griess法检测NO水平. 培养6 h后收集细胞上清液,ELISA法检测TNF-α及IL-6水平.

1.4.9 Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白表达 细胞以2×106个/孔的密度接种于6孔板,培养24 h后,按上述方法给药并造模,置于培养箱培养24 h.向细胞或关节滑膜组织中加入RIPA缓冲液,超声粉碎后,BCA法测定蛋白浓度. 将等量的蛋白质(25 μg)与上样缓冲液混匀煮沸(95 ℃,5 min)制成蛋白电泳样品. 10% SDS-PAGE电泳分离蛋白并将蛋白转印(106 V,60 min)至PVDF膜,5%脱脂牛奶室温封闭2 h后,加入一抗 (1∶1 000) 4 °C孵育过夜,TBST洗涤3次,二抗(1∶1 000)室温孵育2 h,蛋白条带洗涤,显影后,用图像分析软件Image J分析蛋白表达变化.

1.5 统计学方法

2 实验结果

2.1 Rb1对AIA大鼠继发侧足肿胀及关节炎指数的影响

造模后第14天,大鼠继发侧足肿胀及关节炎指数明显增大. 与模型组比较,地塞米松,Rb1 10 mg/kg及Rb1 20 mg/kg能显著抑制足肿胀(图2(a)). 与模型组比较,地塞米松及Rb1 20 mg/kg显著减小了关节炎指数评分(图2(b)).

2.2 Rb1对AIA大鼠关节组织病理的影响

HE染色结果显示,模型组大鼠关节可见明显的炎细胞浸润,滑膜增生,血管翳生成及骨破坏(图3(a)). 地塞米松,Rb1 10 mg/kg及Rb1 20 mg/kg能显著减轻以上症状(图3(b)).

2.3 Rb1对AIA大鼠血清炎症细胞因子的影响

ELISA结果显示,模型组血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显升高. 与模型组比较,地塞米松,Rb1 10 mg/kg及Rb1 20 mg/kg能显著降低上述炎症因子水平(图4).

2.4 Rb1对AIA大鼠免疫器官指数及组织病理学的影响

与对照组比较,模型组脾脏指数明显增大.与模型组比较,地塞米松组胸腺及脾脏指数显著减小,而Rb1组胸腺及脾脏指数无明显变化(图5(a)、5(b)).

HE染色结果显示,模型组脾脏组织白髓增生,淋巴细胞聚集,胸腺组织真皮髓质和淋巴细胞无清晰界限. 与模型组比较,地塞米松组淋巴小结显著减少和萎缩,胸腺组织延髓体积缩小,而Rb1组无明显病理改变(图5(c)、5(d)).

2.5 Rb1对LPS诱导的RAW264.7细胞NO水平的影响

Griess结果显示,LPS刺激后,模型组NO释放量显著增加,与模型组比较,地塞米松及Rb1可显著抑制细胞NO的产生,且抑制作用呈明显的浓度依赖性(图6).

2.6 Rb1对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α及IL-6水平的影响

ELISA结果显示,LPS刺激后,模型组TNF-α及IL-6的分泌明显增加,与模型组比较,地塞米松及Rb1可显著抑制细胞TNF-α(图7(a))和IL-6(图7(b))的分泌.

2.7 Rb1对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示,与对照组比较,模型组关节滑膜p-IκBα及p-p65表达明显上调. 与模型组比较,地塞米松及Rb1 20 mg/kg能显著降低滑膜p-IκBα及p-p65的表达(图8(a)、8(b)).

与对照组比较,模型组经LPS刺激后可下调RAW264.7细胞中IκBα的表达,与模型组比较,地塞米松及Rb1可显著上调IκBα的表达(图8(c)).

3 讨 论

RA是一种进行性、终生性疾病,可将预期寿命缩短3～20年,发病机理复杂. 目前,RA的治疗重点主要是缓解疾病进展,减轻症状和改善生活质量．

AIA模型因其与人类RA组织学和免疫学相似而被广泛用于RA新药和靶标的确定[12]. 根据先前研究制备了AIA大鼠并给予相应药物治疗,结果显示,Rb1可显著减轻大鼠足肿胀,抑制滑膜增生、血管翳生成及骨破坏,降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平. 在体外,Rb1还能降低LPS诱导的RAW264.7细胞中NO,TNF-α及IL-6的分泌. 表明Rb1在体内外均具有较好的抗炎作用.

GCs长期使用副作用较多,如免疫抑制、骨质疏松和代谢紊乱等,限制了其使用[13]. 因此,我们检测了阳性药地塞米松与Rb1对AIA大鼠免疫器官的影响. 研究发现,地塞米松显著抑制大鼠的免疫功能,而Rb1对大鼠免疫器官指数及组织病理学无明显改变. 因此,与GCs不同,Rb1发挥抗炎作用的同时无明显免疫抑制作用,安全性好.

据报道,NF-κB信号通路在炎症反应中起重要作用. 正常情况下,NF-κB与抑制剂IκB结合而在细胞质中失活,在外界刺激下,IκB磷酸化并降解,释放NF-κB亚基以进行核易位并激活包括炎症因子在内的多种响应基因[14]．本研究结果显示, AIA大鼠滑膜p-IκBα及p-p65水平明显上调,LPS刺激后细胞中IκBα的表达下调,体内外均证实了NF-κB的激活．而Rb1能显著抑制以上蛋白变化,从而抑制NF-κB的激活.

以上结果提示,Rb1对AIA大鼠具有保护作用,其保护作用可能是通过抑制关节滑膜中NF-κB信号通路的激活实现的.