李智念 羊炼 刘露

摘 要：通过优化PCR反应体系和反应程序，本文建立了使用猕猴桃枝条为样品，直接检测猕猴桃溃疡病PSA病原菌的方法。该方法跳过了病原菌培养和DNA提取步骤，大大缩短了检测时长，利用微型PCR仪系统，使针对猕猴桃溃疡病的简单、低成本、快速现场检测成为可能。

关键词：猕猴桃溃疡病;检测方法;直接PCR

中图分类号：S436.634文献标识码：A文章编号：1003-5168（2020）20-0139-03

Abstract： By optimizing the PCR reaction system and reaction program， a method for directly detecting the pathogenic bacteria of kiwi fruit ulcer PSA by using kiwi twigs as a sample was established in this paper. The method skips the steps of pathogen culture and DNA extraction， greatly shortens the detection time， and utilizes a micro-PCR system， which makes simple， low-cost and fast on-site detection for kiwi fruit ulcer possible.

Keywords： kiwi fruit ulcer;detection method;direct PCR

近年來，我国猕猴桃种植面积不断增加，细菌性溃疡病快速蔓延[1-2]。在没有特效防治药品的现状下，加强外引苗木的检疫、及早清除园中感染植株是防范溃疡病，避免果园全军覆没的重要手段。植株感病的早期虽然不表现出相应性状，但已经具备传播扩散致病菌的能力，要及早发现已染病植株并不容易。

PCR检测能够高效准确地鉴定出PSA病原菌，但现有的方法一般要首先采样培养病原菌，然后提取培养出的菌落DNA，再进行PCR检测。这样的流程需要专业人员操作，很难应用到猕猴桃园的常规检测。面对基层猕猴桃园主的自主快速检测方法，目前国内还少有报道。本研究通过优化普通PCR的反应体系与程序，跳过病原物培养和DNA提取过程，直接以猕猴桃枝条为样本进行PCR反应;整合现有仪器设备，避开了常规PCR试验对高速离心机、成像系统或荧光定量系统的依赖，建立了一套简单、可靠、准确、快速、低成本的检测方法，旨在为发展出一种基层猕猴桃园主用得起、用得上的猕猴挑溃疡病早期检测技术，为我国猕猴桃栽培的健康发展提供帮助。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

从明显发生溃疡病的猕猴桃枝条中分离保存的PSA病原菌。

1.2 猕猴桃枝条

分别以明显发生溃疡病的猕猴桃枝条（见图1）、未见病征的猕猴桃枝条（见图2）和已确认未感染PSA病原菌的猕猴桃枝条（见图3）为样品。

1.3 PCR引物

通过文献分析选取P3F/P5R（5′-GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG-3′，5′-CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGAC-3′）[3]用于PCR检测，由上海生工进行合成。

1.4 猕猴桃枝条组织取样量的确定

直接PCR检测反应对样品用量由一定要求，样品量太少，会导致底物含量过低，无法完成检测;样品量太多会污染PCR反应体系，导致目标片段的扩增无法顺利完成[4-9]。为确定取样量的范围，本试验以ddH2O为阴性对照，以稀释后的猕猴桃PSA菌液为阳性对照，通过取不同质量的健康枝条样品与PSA菌液混合进行PCR检测来确定样品取样量的上限，通过从感病枝条中取不同重量样品进行PCR检测来确定样品取样量的下限。

PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix10ul，上下游引物各0.5 μL，DNA模板10 μL。反应条件为：预变性95 ℃ 3 min; 95℃变性10 s，58 ℃退火30 s;72 ℃延伸20 s，38个循环;72 ℃延伸5 min;20 ℃保存。用2%琼脂糖凝胶电泳法检测，核算染料为低毒的GelRed染料。

1.5 检测系统的轻简化验证

常规PCR结果判读一般是，通过凝胶成像系统底部的紫外灯管，激发镶嵌了核酸染料的DNA片段发出荧光，再通过顶部的相机镜头拍摄下条带的照片，传输至计算机，呈现结果。为了适应基层低成本轻简化的操作需求，人们可以尝试使用紫外手电筒代替成像系统来激发条带，直接目测判读的方式来解读PCR结果。

2 结果与分析

2.1 取样量对PCR反应的影响

分别取1、0.5、0.1、0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002、0.001 g确定未感染猕猴桃PSA菌的健康枝条，将其分别加入500 μL含有PSA菌的ddH2O中捣碎，取10 μL捣碎后的样品混合液作为反应底物，进行PCR反应;以ddH2O为阴性对照，以稀释后的猕猴桃PSA菌液为阳性对照。如图4所示，PCR结果表明，阳性对照扩增出目标条带，而阴性对照未出带，与预期相符，即反应体系正常工作;样品质量在0.001～0.020 g的反应都扩增出条带，并且以0.008 g样品所对应的条带亮度最高，而0.05～1.00 g样品质量对应的反应都未见条带。这表明在本检测体系条件下，最适的取样量为0.008 g左右，样品量高于0.02 g则很可能会打乱反应体系，导致检测PCR扩增无法进行。

分别取1、0.5、0.1、0.05、0.02、0.01、0.008、0.005、0.002、0.001 g确定明显感染猕猴桃PSA菌的枝条，将其分别加入500 μL的ddH2O中捣碎，取10 μL捣碎后的样品混合液作为反应底物，进行PCR反应;以ddH2O为阴性对照，以稀释后的猕猴桃PSA菌液为阳性对照。如图5所示，PCR结果表明，阳性对照扩增出目标条带，而阴性对照未出带，与预期相符，即反应体系正常工作;样品量在0.008～0.020 g的反应都扩增出条带，并且以0.008 g样品所对应的条带亮度最高，而0.05～1.00 g样品质量和0.000 1～0.0050 g样品质量对应的反应都未见条带。这表明在本检测体系条件下，取样量低于0.005 g会导致模板量过低，无法检测出已感病材料。

通過对不同取样量的检测结果分析可知，在21 μL反应体系下，取0.008～0.050 g的猕猴桃枝条组织，加入ddH2O（可用怡宝纯净水代替）中捣碎，取10 μL混合液作为PCR反应的底物，能完成猕猴桃PSA病原菌的直接PCR检测。

2.2 轻简化系统的可行性验证

为适应基层果园无专业分子生物学实验室、无专业分子检测人员的应用场景，将实验室已经验证的方法进行了设备和试剂进行轻简化尝试。

试剂准备阶段：将500 μL怡宝纯净水装入1.5 mL EP管中;将引物与PCR反应MIX制成预混液，并分装入PCR反应管中冷冻保存;将2%琼脂糖凝胶制作完成后，用自封袋密封保存;将10 mL的50倍TAE母液装入塑料试管保存。

模拟使用阶段：分别取检测范围内的健康枝条样品、染病枝条样品，加入预装500 μL纯净水的EP管中，小研磨辊磨碎，取10 μL加入预装有反应液的PCR管中，上微型PCR仪器，以预定程序反应。将预装的TAE母液倒入新开的怡宝纯净水中，摇匀制成电泳缓冲液体。将完成反应的PCR产物上样到预制的琼脂糖凝胶中，在微型电泳仪上进行电泳反应。电泳完成后用紫外手电筒照射，进行目视判定，染病枝条样品出现明显的亮条带，而健康枝条样品并未出现条带，如图6所示。

3 结论

随着对猕猴桃溃疡病菌（丁香假单胞菌猕猴桃变种Pseudomonas syrimgae PV.actinidiae，PSA）[10-13]研究的深入，基于普通PCR的检测方法已经被逐渐建立和完善，如已报道的KN-RCR[14]、RG-PCR[15]等技术;也有基于定量PCR技术的检测方法被报道。这些技术的建立，帮助专业人员准确地区分出PSA和其他相似菌株，可以对无病征、未发病的果园进行早期检测。但是，这些检测需要在专业的分子实验室进行，需要具有相应分子生物学专业技能的人员操作，耗时较长，检测成本较高。基层果园主难以应用PCR技术开展自主检测，在日常果园管护中早发现、早处理还不现实。本研究通过实验室验证，建立了一套应用普通PCR检试剂、傻瓜化检测的方法，无须专业背景即可在说明指导下完成操作，结果准确。该方法所需仪器极为轻简，相对于建立整套分子实验室，成本低廉。本研究建立的猕猴桃溃疡病快速检测方法，降低了检测操作难度、检测成本，缩短了检测时间，应用前景广阔。

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